实验性急性血栓性肺栓塞动物模型的建立

[摘要] 目的 建立操作简便、成功率高、趋近真实、耗资低廉的急性血栓性肺栓塞（acute pulmonary embolism APE）动物模型。方法 首先，将兔麻醉，暴露并切开左侧颈静脉后，插入一5F导管。然后，经此导管注入2-3个自体栓子，栓子则会顺血液循环栓塞肺动脉，从而造成急性血栓性肺栓塞。待兔存活足够时间后进行尸解，并取出诸如：栓塞的和非栓塞的肺动脉、心脏、主动脉、肝脏和脂肪等器官和组织。结果 本法的肺栓塞率为100%,动物模型的成功率为87.18%。尸解表明，大多数栓子栓塞于肺动脉段水平。结论：用该方法建立急性血栓性肺栓塞具有很高的科研价值和可行性。

在全世界范围内，急性血栓性肺栓塞及其原发病深静脉血栓形成的罹患者已达数百万，且发病急、病情重，严重威胁着人类的生命和健康。在该病的科研中，肺栓塞动物模型具有至关重要的作用，遗憾的是目前国内外的该类模型都存在明显不足。经不断摸索，我们建立了自己的兔急性肺栓塞动物模型，该法具有操作简便、成功率高、趋近真实、耗资低廉的优点，从而为该病的研究提供了坚实的物质基础和实验平台，现介绍如下。

1  材料与方法

1.1 实验对象 选用新西兰纯种家兔39只，体重2.5-3.0kg，雌雄不限。

1.2 栓子制作 在无菌条件下，自耳缘静脉取血2ml，加入20U凝血酶后于5ml注射器内混匀，室温下静置过夜，形成牢固血栓。将其制成直径2-4mm，长7-10mm的圆柱形栓子后备用。

1.3 麻醉 经静脉缓慢推注戊巴比妥钠，剂量为30mg/kg，每半小时检查一次麻醉深度，必要时可追加麻醉，剂量为1-2mg/kg。

1.4 肺栓塞模型制作 颈部剪毛后，先用碘伏、酒精局部消毒，再行一长约2cm的横向切口。暴露并切开左侧颈静脉，插入5F导管，深度约4-5cm或直至右心房，经导管注入栓子后快速推注生理盐水5ml以防栓子滞留于导管或颈静脉内，栓子数目以2个为宜。结扎颈静脉并缝合切口后，持续密切观察家兔的体征变化直至解剖。整个过程家兔应始终保持仰卧位。

1.5 解剖 达实验所需时限后，将家兔再次麻醉、打开胸腔、腹腔后，迅速取出肺脏、心脏、肝脏、主动脉和脂肪等器官和组织。然后，沿其走行剥离肺动脉树。因肺组织失血变白，可很快找到注入栓子，再以其为标志区分并获取所需栓塞或非栓塞的肺动脉及其相应肺组织。全部操作应在无菌条件下进行，力争半小时内完成。

2  结果

2.1  本组兔肺栓塞模型的建立方法成功率为87.18%(34/39)，死亡率为12.82%(5/39)。注入栓子后10-20min，家兔均出现呼吸急促、口唇紫绀和肺内有干湿罗音等肺栓塞体征，经数字减影检查及解剖证实，模型建立成功（见图1 和图2）。

图1: 右肺上叶可见显影; 中叶和下叶均未见肺动脉影像；左肺上叶和中叶近端可见显影，中叶肺动脉段级以下未见显影。后经解剖证实，肺内发现4个栓子。
图2：右肺上叶和部分中叶显影；左肺上叶未见肺动脉影像，中叶肺动脉段级以下未见显影。与解剖结果一致。

2.2  解剖结果显示，肺栓塞发生率为100%。解剖发现，正常兔肺叶数与人略有不同，左侧一般为2-3叶，右侧3-4叶，两肺中叶均较大。肺动脉节段检查总数为374个，发现栓子113个，平均每只2-5个，且多数位于肺动脉段水平。栓子检出数大于注入数，分析可能为栓子于运行过程中破裂所致。栓子的具体分布如下：叶动脉内11个，段动脉内72个，亚段动脉内30个。
由于研究不同时间凝血及纤溶因子基因表达的需要，我们将兔的栓塞后生存时间人为设定成3组，分别为栓塞后3h组、8h组和24h组。其中，3h组和8h组肺动脉内栓子均较饱满，肺动脉阻塞完全，较少有溶解和破碎。与之不同的是，栓塞24h组可见栓子质地明显松软，数目明显减少（约1-3个/只），且部位多更靠近肺动脉树远端。究其原因，考虑为纤溶系统继发激活的结果。

3  讨论

早期国外多选用犬来建立肺栓塞模型，主要因为犬体积大，操作方便，但有实验成本高，犬类性凶猛的不足。随着分子生物学的发展，近年来多选用大鼠，但同时也暴露出体积小、操作难的缺点。以上诸多原因促使我们选用家兔建立肺栓塞模
型，主要有如下优点：一是体形适当且成本低，模型建立便捷。二是所需研究因子的cDNA序列查找较易。三是体积比鼠大，利于做肺的数字减影检查和查找栓子。

另外，因颈静脉靠近心脏，栓子运行的路径短，栓子破碎的机会相对少，从而我们摒弃了过去以股静脉作为栓子入口的传统方法，开创性地选择了颈静脉，增强了实验的可控性。

在栓子的制作过程中添加凝血酶，主要目的是使栓子牢固不易破碎以利于操作和提高成功率。这种方法不但操作简便，而且用自体血栓栓塞来代替使用微明胶球、金属环和结扎肺动脉的传统方法，可更趋近于疾病的真实情况，更利于探索疾病原本的病理生理变化。另外，栓子的大小和数目对模型的成功建立也至关重要，因为如果栓子太小、太少就会不易找到，不利于栓子的发现和肺动脉的取材，而栓子太大、太多则容易造成大面积肺栓塞致家兔快速死亡。考虑到以上情况，我们就先在预实验中观察了各级肺动脉内径和走行，以将要栓塞肺动脉段和亚段水平为依据，将栓子规定为直径2-4mm，长7-10mm大小，栓子的数目以两个为宜。在39只肺栓塞家兔中，共死亡5只，仅一只因大面积肺栓塞致死，另外4只是因为麻醉过量所致。值得一提的是，在栓塞后大约2-3h，家兔便能自由活动，显示出该方法创伤小、恢复快的优点。

总之，用本方法建立急性血栓性肺栓塞动物模型具有很高的科研价值和可行性，可作为系统研究该病的基石。