神马文学网工业微生物菌种的选育——诱变选育（2）
来源：百度文库 编辑：神马文学网 时间：2024/04/28 21:00:30
来源：青岛海博
突变菌株分离和筛选方法
（1）、随机筛选
又称摇瓶筛选，该法主要是随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选，做法是：将诱变处理后的菌体分离在琼脂平板上，培养后随机挑选菌落，一个菌落移入一支斜面，一个斜面的菌体接入一只三角瓶，振荡培养，根据测定产物活性，决定取舍。优点是发酵过程的生产条件、生理条件与大规模生产条件相近，可以模拟进行。
（2）、平板菌落预筛
A、根据形态筛选突变株
部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性。
B、根据平板菌落生化反应筛选变株
透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。
C、采用冷敏感菌筛选抗生素变株
主要用来筛选抗生素产生菌株。冷敏菌：从人的病原菌中经诱变分离出的，在20℃下不能生长。筛选原理：将冷敏菌和诱变后的放线菌孢子悬浮液混合，分离在同一培养基平板上，置于20℃培养3-4天，抗生素产生菌不受干扰，能正常形成菌落，冷敏菌不生长。当放线菌菌落成熟，并且抗生素产量达高峰，将培养皿移至37℃培养18-24h,冷敏菌迅速生长，而此时在抗生素产生菌落周围的冷敏菌因生长受到抑制而形成抑菌圈。根据菌落直径和抑菌圈直径之比的有效值，可以直接筛选出抗生素高产突变株。
D、浓度梯度法
主要用来筛选抗生素产生菌株。 原理：菌株产生抗生素水平受到它自身所产抗生素数量的制约，耐受性越高，抗生素产生能力也就越强。通常采用双层法制浓度梯度平板，用涂布法接种，培养后，挑取高浓度抗生素区域的菌落，易于筛选到抗性变株。
摇瓶液体培养
产物活性鉴定
摇瓶初筛阶段测定产物的几种简便方法。
（1）、琼脂平板活性圈法
该法是在特制的玻璃框琼脂平板上进行的，以检验菌或底物与一定量的琼脂制成平板，用专制的打孔器取出琼脂块，在留下的圆孔中加入发酵液，或用圆滤纸片浸透发酵液直接覆于琼脂平板上，在适合温度下培养一定时间，测量圆孔或滤纸片周围形成的抑菌圈或水解圈，根据活性圈的大小挑选高产菌株。
（2）、纸片法
随着诱变代数的增加，有效产物浓度不断提高，当发酵液中产物浓度相当高时，活性圈大小与产物浓度之间失去线性关系，掩盖了菌株的高产性能而被漏筛，此时可采用纸片法：取直径0.5cm圆纸片，灭菌后覆于琼脂平板上，准确取发酵注1~2ul在滤纸片上，培养20~25h，测量水解圈大小。如果活性圈仍然很大（直径15mm以上），则可将发酵液稀释，或增加底物浓度和琼脂板的厚度，使水解圈控制在一定范围内。
（3）、琼脂薄层纸片法
此法适合抗真菌抗生素和农业抗生素野生菌的初筛和诱变菌株的初筛，适合对大量菌株和多种产孢子的真菌、病源菌为对象的综合筛选。制备检验菌的孢子悬液，与真菌固体培养基混匀，倾入玻璃析上，均匀摊平，制成厚度约1mm的薄层琼脂板，将滤纸片依次覆于薄层琼脂板上，加入1~2ul发酵液，上盖一块过的玻璃板，放入底部有浸湿纱布的盘内，以做便保湿，于适宜的温度下培养3~4天，观察孢子萌发、菌丝形态，并测量抑菌圈大小。
培养基和培养条件的调整
一个突变株由于基因突变，失去生理特性的平衡，同时也因此降低了与原来环境条件的适应能力。由于这种环境因素的选择作用，不适应的突变株优良性状不能表达，甚至被淘汰。在实际工作中，当筛选到一个优良菌株时，要调整培养基配方和培养条件，使突变株处于一个适应的环境中得到充分表达。
突变株的特性研究与鉴定
研究菌种纯度、遗传稳定性、菌落形态、群体形态、生活能力、产孢能力、保藏培养基和保藏方法；研究碳氮源利用情况、菌丝生长速度、菌丝量、发酵液粘度；最适合接种量、移种量、通气搅拌、温度、PH等。从分子水平进一步对突变株的生理生化特性加以鉴定。
突变菌株分离和筛选方法
（1）、随机筛选
又称摇瓶筛选，该法主要是随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选，做法是：将诱变处理后的菌体分离在琼脂平板上，培养后随机挑选菌落，一个菌落移入一支斜面，一个斜面的菌体接入一只三角瓶，振荡培养，根据测定产物活性，决定取舍。优点是发酵过程的生产条件、生理条件与大规模生产条件相近，可以模拟进行。
（2）、平板菌落预筛
A、根据形态筛选突变株
部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性。
B、根据平板菌落生化反应筛选变株
透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。
C、采用冷敏感菌筛选抗生素变株
主要用来筛选抗生素产生菌株。冷敏菌：从人的病原菌中经诱变分离出的，在20℃下不能生长。筛选原理：将冷敏菌和诱变后的放线菌孢子悬浮液混合，分离在同一培养基平板上，置于20℃培养3-4天，抗生素产生菌不受干扰，能正常形成菌落，冷敏菌不生长。当放线菌菌落成熟，并且抗生素产量达高峰，将培养皿移至37℃培养18-24h,冷敏菌迅速生长，而此时在抗生素产生菌落周围的冷敏菌因生长受到抑制而形成抑菌圈。根据菌落直径和抑菌圈直径之比的有效值，可以直接筛选出抗生素高产突变株。
D、浓度梯度法
主要用来筛选抗生素产生菌株。 原理：菌株产生抗生素水平受到它自身所产抗生素数量的制约，耐受性越高，抗生素产生能力也就越强。通常采用双层法制浓度梯度平板，用涂布法接种，培养后，挑取高浓度抗生素区域的菌落，易于筛选到抗性变株。
摇瓶液体培养
产物活性鉴定
摇瓶初筛阶段测定产物的几种简便方法。
（1）、琼脂平板活性圈法
该法是在特制的玻璃框琼脂平板上进行的，以检验菌或底物与一定量的琼脂制成平板，用专制的打孔器取出琼脂块，在留下的圆孔中加入发酵液，或用圆滤纸片浸透发酵液直接覆于琼脂平板上，在适合温度下培养一定时间，测量圆孔或滤纸片周围形成的抑菌圈或水解圈，根据活性圈的大小挑选高产菌株。
（2）、纸片法
随着诱变代数的增加，有效产物浓度不断提高，当发酵液中产物浓度相当高时，活性圈大小与产物浓度之间失去线性关系，掩盖了菌株的高产性能而被漏筛，此时可采用纸片法：取直径0.5cm圆纸片，灭菌后覆于琼脂平板上，准确取发酵注1~2ul在滤纸片上，培养20~25h，测量水解圈大小。如果活性圈仍然很大（直径15mm以上），则可将发酵液稀释，或增加底物浓度和琼脂板的厚度，使水解圈控制在一定范围内。
（3）、琼脂薄层纸片法
此法适合抗真菌抗生素和农业抗生素野生菌的初筛和诱变菌株的初筛，适合对大量菌株和多种产孢子的真菌、病源菌为对象的综合筛选。制备检验菌的孢子悬液，与真菌固体培养基混匀，倾入玻璃析上，均匀摊平，制成厚度约1mm的薄层琼脂板，将滤纸片依次覆于薄层琼脂板上，加入1~2ul发酵液，上盖一块过的玻璃板，放入底部有浸湿纱布的盘内，以做便保湿，于适宜的温度下培养3~4天，观察孢子萌发、菌丝形态，并测量抑菌圈大小。
培养基和培养条件的调整
一个突变株由于基因突变，失去生理特性的平衡，同时也因此降低了与原来环境条件的适应能力。由于这种环境因素的选择作用，不适应的突变株优良性状不能表达，甚至被淘汰。在实际工作中，当筛选到一个优良菌株时，要调整培养基配方和培养条件，使突变株处于一个适应的环境中得到充分表达。
突变株的特性研究与鉴定
研究菌种纯度、遗传稳定性、菌落形态、群体形态、生活能力、产孢能力、保藏培养基和保藏方法；研究碳氮源利用情况、菌丝生长速度、菌丝量、发酵液粘度；最适合接种量、移种量、通气搅拌、温度、PH等。从分子水平进一步对突变株的生理生化特性加以鉴定。
工业微生物菌种的选育——诱变选育（2）
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