第二章 发酵工业菌种

◎常用的工业微生物◎发酵工业菌种筛选的原则与基本技术◎赖氨酸生产菌的育种思路





学时安排：4学时
教学目的与要求：（1）掌握微生物分离筛选的基本概念、基本原理与基本技术；（2）掌握菌种改良的基本原理、基本技术和方法。
技术和方法重点及难点：菌种改良的技术原理和方法
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两条经验：1）进化上向上兼容；
2）次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才有筛选意义。
1．细菌
醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌
乳酸杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌
丙酮丁醇羧菌
谷氨酸棒状杆菌
2. 酵母菌
酿酒酵母
假丝酵母属：产朊、解脂、热带假丝酵母
毕赤酵母属、汉逊酵母属
3. 霉菌
曲霉属：米曲酶、黑曲酶
青霉属：点青霉、产黄青霉、桔青霉
根霉属：德氏根霉、米根酶、小麦曲根霉
红曲霉属
4. 放线菌
链霉菌属
小单孢菌属
地中海诺卡氏菌
米苏里游动放线菌
未培养微生物：
（1）定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99％。
（2）研究方法
模拟自然培养法
宏基因组分析法
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（一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求
1.  菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌
自然选育→代谢控制育种
诱发基因突变→基因重组的定向育种
2. 菌种选择的要求
（1）能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；     （2）生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；                                        （3）培养条件易于控制；
（4）抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
（5）菌种不易变异退化；
（6）对放大设备的适应性强；
（7）菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。
（二）分离筛选原理与技术
1. 筛选的两种指导思想

2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
1）从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；
2）生产中长期使用的菌种的定期分离筛选；
3）从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株；
4）从已知菌种和大自然中分离新菌株
①寻找新的发酵产品的产生菌；
②寻找老产品的新的优良菌株。
选择筛选方法时必须考虑两个要点：
（1）选择性
（2）灵敏度
3. 新种分离与筛选的步骤

1） 含微生物样品的采集
采样时应注意的问题:
①土壤微生物的分布
②采土深度
③土壤植被情况
④采样季节
⑤土壤的酸碱度
对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：
①土壤来源广泛
②在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种
2) 样品的预处理目的：提高分离效率
方法：
⑴物理方法：热处理；膜过滤法；离心法
⑵化学方法
⑶诱饵法
3)分离方法的选择 根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法：
选择性分离：a. 菌种的营养特征独特
b.生长特征独特
若无选择性特征: 根据产物的特征进行随机分离
选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。
（1）选择性分离原理和技术
生长条件的选择与控制原理控制营养成分
控制培养基酸碱度
添加抑制剂
控制培养温度
控制通气条件
（2）选择性分离技术
富集液体培养技术
固体培养技术
A. 富集液体培养
a.增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术
b.技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件
c.培养方式
分批培养方式：以最大比生长速率（μmax）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题
连续培养方式：以比生长速率（μ）筛选
B. 连续富集培养技术分离菌株的优点：
a.分离的菌株特别适合连续发酵生产过程
b.有利于分离具有某种工业生产特性的菌株
c.可以筛选出能共生的稳定混合培养物
C. 固体培养技术
a.常用于分离某些酶产生菌
b.选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质
（2）随机分离原理与技术
① 从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。
② 技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。
③ 高产培养基设计的几个原则
a.制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素；
b.使用一聚合或复合形式的生长限制养分；                                             c.避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻遏；
d.确定含有所需的辅因子（Co2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+）；
e.使用pH缓冲剂以减少pH变化；
f.前体、促进剂及抑制剂的采用。                                                      ④随机分离技术举例
A．抗生素产生菌的筛选
a.筛选模型：试验菌
b.筛选方法：
固体培养筛选：铺菌法；复印平板法
液体培养筛选
抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同                             I               II
无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大
有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性
B．药理活性化合物产生菌的筛选
a.药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到治疗的目的。
b.筛选模型：目标酶
C．生长因子产生菌的筛选
a.筛选模型：营养缺陷型试验菌
b.筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌生长
氨基酸产生菌的筛选：

D．多糖产生菌的筛选
a.取样特点：碳水化合物工业的废弃物
b.筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。
（三）应用举例
1．细菌分离：以乳酸菌为例                                                           2．放线菌的分离：以产链霉素菌种的分离为例（从退化菌种中筛选）                    3．真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例。
※赖氨酸生产菌的育种思路赖氨酸生产菌的育种
1. 出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌
2. 育种思路
(1) 优先合成的转换——渗漏缺陷型的选育
(2) 切断支路代谢——营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型
(3) 抗结构类似物突变株的选育：AEC
(4) 解除代谢互锁：Leu- 、抗Leu结构类似物、喹啉s 、苯醌s
(5) 增加前体物的合成和阻塞副产物的生成：
Ala-、抗Asp结构类似物
选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株
(6) 改善细胞膜的透过机能
(7) 选育温度敏感突变株
(8) 应用细胞工程和遗传工程育种

（一）代谢工程的定义
利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。代谢工程又称作途径工程，是多基因的基因工程。
（二）发展基础
1．代谢网络理论：是把细胞的生化反应以网络整体，而不是孤立地来考虑。
2．代谢网络分流处的代谢产物称为节点，其中对终产物起决定作用的少数节点称为主节点。
3．根据节点下游分支的可变程度，节点分为：
(1)柔性节点： 解除一个分支的反馈抑制可提高该分支下游产物的产量。
(2)半柔性节点：须降低主分支的酶活并同时提高次分支的酶活或解除其反馈抑制，才可提高次分支下游产物的产量。                                                               (3)刚性节点：其下游各分支的比例不易改变。
4. 相依网络：代谢网络中各主节点集中于产物，为了避免中间物的过量积累，各分支的代谢流都必须保持平衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。
独立网络：代谢网络的主节点不集中，可以通过对代谢的修饰来影响产物的产量,其对代谢改变的应答将取决于各节点的刚柔性及其位置。

（三）代谢工程育种思路
1．改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，阻断有害代谢产物的合成.
（1）加速限速反应
（2）改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目的代谢末端产物的产量。
（3）构建代谢旁路
（4）改变能量代谢途径
2. 扩展代谢途径
（1）在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端代谢产物。
（2）使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料生物合成代谢末端产物。
3. 转移或构建新的代谢途径
（1）为生产某一新的化学结构的代谢产物，将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一不具备该种能力的微生物中，达到代谢途径转移的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。
（2）利用基因工程手段，通过克隆少数基因将原来细胞中无关的两条代谢途径桥连在一起，形成新的代谢途径。
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