副溶血弧菌对养殖大菱鲆致病性研究

副溶血弧菌对养殖大菱鲆致病性研究 
胡 亮，赵凤梅，于兰萍，李 艳，王斌
(大连水产学院，农业部海洋水产增养殖与生物技术重点开放实验室，辽宁大连116023)
摘要：从患出血症的大菱鲆体内分离到5株菌，编号为L一0603314、L一0603442、L一0603431、L一
0603121、L一0603241。采用肌肉注射的方法进行人工感染，每尾注射0．05 ml，菌浓度为10。cfu／ml和
10’cfu／ml；采用K—B法用青霉素、环丙沙星、四环素、呋喃妥因、红霉素、庆大霉素、链霉素7种药敏纸
片对确定病原性的菌株进行抗生素敏感试验，同时进行生理生化特性研究。结果显示，L一0603121菌
株为3．0×10 cell／ml时只引起个别试验个体轻微症状，1．0×10 cell／ml可造成100％感染率，40％ 死
亡率，可确定L一0603121菌株为引起大菱鲆出血症的致病菌株。药敏试验表明，L一0603121株菌对庆
大霉素、红霉素、链霉素、呋喃妥因敏感。根据形态观察、生理生化特征等试验结果，确定L一0603121
株菌为副溶血弧菌。
关键词：大菱鲆；出血症；副溶血弧菌
中图分类号：s917 文献标识码：A 文章编号：1003．1l11(2008)07-0340-04
大菱鲆(Scophthalmus maximus)原产于西欧
沿海，是当前欧洲的重要海水养殖鱼类之一，1992
年引种到我国，1998年形成大规模产业化养殖的局
面 J。该鱼具有生长快、抗病力强、肉质鲜美、商品
价值高等优点，现已成为我国北方沿海养殖的优良
品种，年创产值超过15亿元。然而随着养殖密度
的增加，水体环境的恶化，各种细菌性疾病时有发
生 4。，且有愈演愈烈之势。其中细菌性疾病是大
菱鲆养殖中危害最为严重的一种疾病，国内外报道
的大菱鲆细菌性病原主要有弧菌属的鳗弧菌(V／b—
rio anguillarum)、灿烂弧菌( solendidus)、海弧菌
( )、溶藻弧菌( alginolyticus)及美人
鱼弧菌( damsela)等 】，其中鳗弧菌在弧菌中
最具代表性，毒力最强，可导致大菱鲆苗和成鱼的
大规模死亡。此外，嗜水气单胞菌(Aeromonas bydrophila)
、迟缓爱德华氏菌(Ewardsiela tarda)、链球
菌(Streptococcus parauberis)等也可使养殖大菱鲆
致病并造成不同规模的死亡 。笔者对近期发
生出血症的大菱鲆主要脏器中分离到的5株细菌
进行了病原性确定，并用常规使用的7种抗生素进
行了药物敏感试验。此外，对确定病原性的菌株进
行了生理生化特征的测定，为查清该病的病原和研
制有效的防治方法打下基础。
1 材料与方法
1．1 病原菌分离纯化方法
1．1．1 材料来源
材料取自大连湾某大菱鲆养殖场，分离用培养
基为22 16E ¨，药敏纸片购于杭州天和微生物制剂
有限公司等单位。
1．1．2 发病鱼症状、体征及病原菌分离
病鱼腹水明显、体表弥漫出血、轻微突眼、体表
见小疱疹；肝脏出血严重，腹水呈血性或黄色混浊，
镜检见大量脓细胞和运动性强的细菌。
取发病症状典型的濒死病鱼，观察外观症状。
用70％的酒精棉球反复擦拭，对病鱼的腹部和体表
消毒，用无菌剪刀剖开腹腔，观察脏器病变情况。
在无菌操作下取病鱼体表病灶、肝、血和腹水，划线
接种于2216E平板，25℃恒温培养24 h后，挑取形
态特征一致的优势菌落进行纯化培养，转接斜面保
存备用。
1．1．3 病原菌的纯化
取分离平板观察生长情况，挑选生长优势菌单
菌落，同样方法划线分离，纯化3次后取单菌落革
兰氏染色，观察形态确定为纯培养后，转入2216E
斜面25℃，培养24 h后25℃保存备用。
1．2 人工感染试验
人工感染试验所用健康大菱鲆取自山东某大
菱鲆养殖场，平均体长9 am，平均体质量12．74 g。
试验鱼运回后投喂配合饵料常规饲养，4 d后进行
人工感染试验。将纯化后的L一0603314、L一
0603442、L一0603431、L一0603121、L一0603241菌
株，分别用无菌生理盐水从斜面上洗脱，稀释后用
血球计数板计数，分别以10 ～109 cell／ml 2个不同浓
度的菌悬液进行感染试验。感染途径为肌肉注射，试
验分为7组(每组10尾)，分别于大菱鲆背部肌肉处注
射，0．05 ml／尾；水温9～11 cC。定时观察记录，取濒死
鱼的病灶及内脏器官进行细菌再分离。
1．3 药敏试验
采用K—B法，取确定病原的菌株，用无菌生理
盐水从斜面上洗脱后，等量涂布于多个2216E平板
上进行药敏试验。每一平板3片药敏纸片，有链霉
素、红霉素、四环素、呋喃妥因、环丙沙星、青霉素、庆
大霉素，25 cC 24 h培养后测量抑菌圈直径。
1．4 菌种的鉴定
经感染试验确定的病原菌，按《常见细菌系统
鉴定手册》[12]和《微生物学实验手册》[1 提出的方
法进行系统鉴定。包括形态学，生理生化特性，营
养特性及生长特性等经典指标。
2 结果
2．1 病原菌的分离纯化
从病灶处和体腔中分离的5株细菌中，以L一
0603121菌株生长优势最明显(表1)。
表1 5株优势菌群培养特征
2．2 人工感染试验
注射组不同浓度感染试验24～72 h，经L一
0603121菌株感染的鱼明显腹水，轻微突眼，体表见小
疱疹等症状，与自然发病的症状几乎完全相同。菌液
浓度为1．0×10 cfu／ml，0．05 ml／尾时死亡率为
40％ ，感染率为100％。菌液浓度为3．0×10 ofu／
ml，0．05 mE／尾时死亡率为0％，感染率为20％ ，感
染鱼体可再次分离出与试验用菌形态特征完全相
同的细菌。其他菌株和对照组均无症状出现。
表2 注射感染试验结果
试验 感染浓度 注射量感染死亡死亡时感染天
菌编号 cell·ml一 ml·尾一 率／％ 率／％ 间／d 数／d
注：感染天数：注射后有明显症状出现的天数
2．3 药敏试验
共进行了7种抗菌药物抑菌试验，除青霉素、
环丙沙星、四环素外，其他均敏感。其中呋喃妥因、
红霉素效果最好，庆大霉素、链霉素稍差。抑菌情
况见表3。
2．4 菌种鉴定
L一0603121菌株个体形态为G一无芽孢，弯或
直短杆。2216 E平板上为乳白色菌落，不隆起，有
圆心，直径2～3 m／n。氧化酶阳性，青霉素不敏感，
葡萄糖氧化为发酵型，接触酶阳性，对0／129敏感
等一系列指标确定L一0603 121菌株为弧菌科弧菌
属的副溶血弧菌( parahaemolyticus)(表4)。具
体鉴定指标见表5。
表3 L一0603121药敏试验结果
表4 L一06o3121菌生理生化特性
注：“+”阳性．“一”阴性
3 讨论
从患出血症的大菱鲆体内分离得到的L一
0603121菌株可经肌肉注射感染健康大菱鲆，出现
与自然发病完全相同的症状，并从人工感染鱼体内
分离到与感染用菌特征完全相同的细菌，可确定L
一0603121菌株为引起此次大菱鲆出血症的病原。
大菱鲆出血症有较多的报道，最常见的感染菌为迟
缓爱德华氏菌。大连地区近几年常发生由于迟缓
爱德华氏菌感染引起的不同程度大菱鲆出血
症lJ引，此种出血症的临床表现与本次研究的出血
症状几乎相同，只是前者少见体表的小疱疹和突
眼。王斌等¨ 指出大菱鲆出血症不具有病原特异
性，几乎所有细菌感染度均可造成不同程度的体表
出血、内脏出血和腹水。本研究在分离到L一
0603121菌株并经感染试验确定其感染性后，用抗
迟缓爱德华氏菌血清进行过酶联免疫检测，结果为
阴性。证明L一0603121菌株不是迟缓爱德华氏
菌，也说明不同细菌感染可引起相同的出血症状。
在确定L一060312菌株对大菱鲆的感染性后，
按《伯杰氏细菌鉴定手册》提出的方法进行了系统
鉴定。包括形态学，生理生化特性，营养特性及生
长特性等经典指标，确定L一0603121菌株为弧菌
科弧菌属的副溶血弧菌。副溶血弧菌是海洋动物
的主要致病菌之一 j，可引起对虾(斑节对虾
Penaeus mortodon、日本对虾P．japonicus、凡纳滨对
虾Litopenaeus vannamei)、中华绒螯蟹(Eriocheir
sinensis)、九孔鲍(Haliotis diversicolo，．supertexta)、海
水鱼(大黄鱼P．seudosciaena crocea)类等多种水产
动物病害¨ ]。许斌福等 ¨从患败血病的大黄鱼
体内分离到副溶血弧菌并确定了副溶血弧菌的致
病性，经副溶血弧菌感染的大黄鱼有严重的充血、
出血、肝脾肿大及腹水等症状。此外，李清禄等
从患病大黄鱼的肌肉、肝、肾等病灶中分离出3种
致病菌，并确定副溶血弧菌为其中1种，其自然发
病症状及人工感染试验发病症状也有全身出血及
眼球突出，有腹水，肝、脾、肾充血、肿大等体征，与
本试验大菱鲆发病症状几乎相同。有关副溶血弧
菌引起大菱鲆出血症的研究目前未见报道，其致病
机理、患病个体病理变化等有待进一步研究。
对L一0603121菌株共进行了7种抗菌药物抑
菌试验，结果表明：除青霉素、环丙沙星、四环素外，
其余均敏感。其中呋哺妥因、红霉素效果最好，庆
大霉素、链霉素稍差。根据目前养殖行业抗生素滥
用的现状，本研究的结果仅提供一个用药参考，可
按照相关条文规定选择合适的抗生素进行治疗，但
最终解决还需进行免疫预防和环境控制等综合措
施。
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Identification of Pathogenic Bacteria in Turbot Scophthalmus maximus
HU Liang，ZHAO Feng—mei，YU Lan—ping，LI Yan，WANG Bin
(Key Laboratory of Marieulture and Bioteehnology，Agriculture Ministry，Dalian Fisheries University，Dalian 1 16023，China)
Abstract：Five bacterial strains numbered L 一0603314，L 一0603442，L 一0603431，L —O6O3121 and L —
O6o324 1 were isolated from diseased turbot Scophthalmus maximus by musclular injection at a dose of 0．5 ml per
fish containing 3．0×10 cels／ml and 1．0×10 ceils／m1．The sensitive test of antibiotic was done by using sensi—
tive scrip of antibiotics including penicillin，tetoacyclinum，nitrofurantoinum，erythromycinum ，gentamycinum and
streptomycinum．The physiological and biochemical characteristics of the pathogenic bacterium that had been con—
firmed revealed that the strain L一0603121 made several individuals showed slight symptoms in 3．0×10 cell／，m1．
but led to an infection rate of 1oo％ and a mortality of40％ in 1．0×10 cell／，m1
． indicating山at the strain L一
0603 1 2 1 was identified as V／br／o parahaemolyticus in pacini in naceae veron．Sensitive test of antibiotic man—
ifests showed that the strain L —O6o3 1 2 1 was sensitive to gentamycinum
，
erythromycinum ，strptomycinum an d ni—
trofuran toinum．
Key words：Scophthalmus maximus；suthenticate；Vibrio parahaemolyticus
(责任编辑：小舟)
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