白花蛇舌草乙醇提取物对肺腺癌A549/DDP细胞的耐药逆转及其机制_中国论文下载中心_药学...

              作者：高宝安， 陈世雄， 邓红艳， 杨俊，黄骥

【摘要】  目的探讨白花蛇舌草乙醇提取物在体外对肺腺癌A549/DDP细胞株的耐药逆转作用及对多药耐药相关蛋白（MRP）表达的影响。方法MTT法测定白花蛇舌草乙醇提取物对A549/DDP细胞耐药的逆转作用；半定量RT-PCR和Western Blot分别检测肿瘤细胞MRP mRNA和蛋白的表达。结果白花蛇舌草乙醇提取物使A549/DDP细胞对DDP的耐药倍数由10.294下降至5.586；并显著降低A549/DDP MRP mRNA和蛋白的表达。结论白花蛇舌草乙醇提取物可以部分逆转肺腺癌A549/DDP细胞对DDP的耐药；其逆转作用可能通过降低细胞MRP的表达来实现。

【关键词】  白花蛇舌草乙醇提取物； 人肺腺癌A549/DDP细胞； 多药耐药相关蛋白

支气管肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，早期多无症状，不少患者就诊时已经失去了手术治疗时机，因此治疗多采用化疗为主的综合治疗。铂类药物具有广泛的抗瘤谱，是肺癌化疗方案的一线药物，但随着晚期肺癌患者化疗的开展，铂类药物的获得性耐药问题日益严重，影响了化疗的效果。白花蛇舌草（Hedyotis diffusa or Oldenlandia diffusa）为茜草科耳草属植物，中医以全草入药，性寒，味甘淡，归心、肺、肝、大肠经，清热解毒，利尿，主治恶疮肿毒，泻痢等症，临床常用于治疗各类癌症［1］。我们前期研究表明［2］，白花蛇舌草乙醇提取物通过促进肺癌A549细胞的凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖。为了进一步阐明白花蛇舌草抗肿瘤的作用机制，为其应用于肿瘤临床提供实验依据，我们观察了白花蛇舌草乙醇提取物在体外对人肺癌耐药细胞株A549/DDP的耐药逆转作用和对多药耐药相关蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）mRNA和蛋白表达的影响。

　　1   材料
   
　　白花蛇舌草购于湖北省药材公司。取白花蛇舌草全草50 g，粉碎研磨，95%乙醇搅拌浸泡15 d，滤去残渣，水浴至液体全部蒸发干，而后加入ddH2O 50 ml溶解，得到生药浓度为1 g/ml，0.22 μm滤膜过滤除菌，4℃保存，用前用DMEM培养基稀释至所需浓度。四甲基氮唑蓝（MTT），二甲基亚砜（DMSO），胰酶均为美国Sigma公司产品；顺铂（DDP）为山东齐鲁医药公司产品；RPMI1640培养基和DMEM培养基为Gibco公司产品；鼠抗人MRP及β-actin单抗购自美国Santa Cruz公司；胎牛血清为杭州四季清生物工程材料公司产品；其余试剂均为国产分析纯。

　　2  方法

　　2.1   细胞及其培养肺腺癌细胞株A549购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，肺腺癌耐药细胞株A549/DDP由第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所陆俊羽教授惠赠，肿瘤细胞用含10％小牛血清的DMEM培养基，在含5％CO2，37℃饱和湿度的培养箱中培养，0.25％胰蛋白酶消化传代。为保持A549/DDP的耐药性，该细胞培养液含6 mmol/L的DDP，实验前2天更换为无DDP的DMEM培养液。实验用细胞均处于对数生长期。

　　2.2  对肺癌A549/DDP耐药细胞的耐药逆转作用A549和A549/DDP两株细胞经胰酶消化后计数，调整细胞密度为1×105 ml-1，接种于96孔板，每孔100 μl。分设A549组、A549空白组、A549/DDP组、A549/DDP空白组和白花蛇舌草组，白花蛇舌草组为A549/DDP细胞加入终浓度为40 mg/ml白花蛇舌草乙醇提取物。细胞培养24 h后，分别加入终浓度为10，20，40，80，100，200 μmol/L的DDP，终体积为200 ml，每个浓度设6复孔，A549空白组和A549/DDP空白组则加入等体积的DMEM，继续培养72 h后，每孔加入5 g/L MTT 10 ml，继续孵育4h，每孔加入200 ml二甲基亚砜（DMSO）终止，振荡15 min，450型ELISA-Reader酶标仪（Bio-Rad公司）570 nm主波长，630 nm副波长检测吸光度。以空白对照组细胞活力为100％，按公式计算不同浓度DDP对A549、A549/DDP和加入白花蛇舌草的A549/DDP细胞增殖的抑制率。公式：细胞抑制率（%）＝(1－实验组吸光度/空白组吸光度)×100％。采用直线回归法计算DDP的半数抑制浓度IC50值。耐药倍数计算公式：耐药倍数＝耐药株IC50值/敏感株IC50值。

　　2.3  对肺癌A549/DDP耐药细胞MRP mRNA和蛋白质表达的影响

　　2.3.1   半定量RT-PCR检测MRP mRNATRizol裂解培养的A549和A549/DDP细胞（DDP浓度为100 μmol/L），氯仿抽提，异戊醇沉淀，乙醇洗涤干燥获取总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出MRP、内参β-actin基因片段。MRP引物序列参照文献［3］（上海博亚生物公司合成）：上游5'-GTA CAT TAA CAT GAT CTG GTC-3'，下游5'-CGT TCA TCA GCT TGA TCC GAT- 3'，扩增片段长度256 bp。反应条件：预变性94℃5 min进入循环，94℃变性30s，54.5℃退火30 s，72℃延伸60 s，共38个循环，最后72℃延伸5 min。内参β-actin基因引物序列（上海博亚生物公司合成）：上游5'-CAC ACG CAG CTC ATT G -3'，下游5'-AAG GAC TCC TAC GTT G -3'，扩增片段长度141 bp。反应条件：预变性94℃ 2 min进入循环，94℃变性30 s，54.1℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min。反应完成后取5μl IL-5 PCR产物，3 μl β-actin PCR产物及2 μl 5×上样缓冲液，加少量溴乙锭（EB）染色，行2%琼脂糖凝胶电泳。于紫外透射仪上观察电泳结果。用图像分析系统分别测每个目的基因及看家基因β-actin的吸光度（A）值，取目的基因与β-actin的A值比值即相对A值。

　　2.3.2  蛋白免疫印迹试验（Western Blot）检测MRP收集DDP浓度为100 μmol/L的肿瘤细胞，加入细胞裂解液，冰上放置15 min，12 000 r/min离心15 min，取上清，以Bradford法作蛋白质定量后置－80℃贮存备用。灌制10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，封闭，一抗（1∶500），4℃孵育过夜，二抗（1∶5 000），室温孵育2 h，ECL显色。图像经Uvp grabit Image软件测定各条带的吸光度，以各条带的吸光度值与β-actin吸光度值的比值进行细胞间蛋白表达量的比较。

　　2.4   统计学分析所有数据均用±s表示，使用统计软件SPSS13.0进行t检验分析。