酪氨酸激酶受体的小分子抑制剂研究进展-

　　1 表皮生长因子受体

　　 已报道的TK活性的小分子抑制剂许多是表皮生长因子受体（EGFr）家族，包括EGFr、erbB－2、erbB－ 3和erbB－4抑制剂。EGFr家族及EGF的过度表达与癌症的发展和恶化有关，在30％以上乳腺癌病入中可发现EGFr和erbB－2浓度升高。最近EGFr和erbB－ 2的抗体已进入临床试验，Genentech公司的人源化 erbB－2抗体Herceptin（trastuzumab）已获FDA批准，用于转移性乳腺癌的治疗。
　　首次报道的EGFr小分子抑制剂是槲皮素（quercetin，1）和染科木黄酮（金雀异黄素，金转停，genistein，2）等天然黄酮和异黄酮化合物，对ATP有相对较弱的非选择性竞争性。此外，天然的吲哚咔唑（indolecarbazole）星形孢菌素（staurosporlne，3），薰草菌素（lavendustin，4）和制表菌素（erbstatin，5）也都是EGFr较弱的非选择性抑制剂。
　　Levitzky等模拟制表菌素和酪氨酸的羟基合成了一系列化合物，这些化合物通称为酪氨酸磷酸化抑制剂（tyrphostins），比ATP竞争性抑制剂更具选择性。其中AG－18（6）活性最强，对EGFr自身磷酸化的IC₅₀ （半抑制浓度）为35μmol／L；也能抑制血小板行生生长因子受体（DGFr）自身磷酸化，IC₅₀为25μmol/ L。新西兰大学和Parke－Davis公司研究发表了一系列具有抑制EGFr酶活性的二硫代双（1H-吲哚-3-烷酸）类化合物7和8，其IC₅₀分别为18μmol／L和1. 5μmol/L。相应的酰胺类似物PA－145709（9）有较高的src抑制活性，对EGFr及src的IC₅₀分别为20μ mol／L和0.65μmol／L，9对细胞内EGFr自身磷酸化无活性，但能抑制成纤维细胞生长因子受体（FGFr）的自身磷酸化。这些二硫化物的二栖类似物具有更强的src抑制性，如10抑制scr及EGFr的 IC₅₀分别为0.4μmol/L和6.1μmol／L。以各种细胞试验比较类似物11和12的活性，发现12抑制EGF 依赖性细胞增殖的活性比11强9倍。在A431细胞（一种EGFr家族成员过度表达的肿瘤细胞系）异种移植模型上，只有12显示活性，但需经皮下植入泵释药。这些化合物对于ATP或底物都是非竞争性抑制剂，而且抑制作用都是不可逆的。
　　Ciba－Geigy发表了一种星形孢菌素的配基类似物13，它不能抑制EGFr自身磷酸化，但可抑制蛋白激酶C（PKC，一种丝氨酸-苏氨酸激酶）。 13的开环衍生物CGP－53353（14）对EGFr酶活性的IC₅₀为0.7μmol／L，抑制PKC的IC₅₀为80μ mol／L。用纯化的PKC β₂测定，14的IC₅₀为0.41 μmol／L。用A431和SK－OV－3细胞异种移植模型试验，14对肿瘤生长有较好的抑制作用。
　　Parke－Davis公司的喹唑呆衍生物PD－153035 （15）是一种有效的选择性EGFr抑制剂，对EGFr 的IC₅₀为29μmol／L，但即使浓度高达50μmol／L 仍不能抑制其它酪氨酸激酶，如PDGFr、FGFr、集落刺激因子-1受体（CSF－1r）、胰岛素受体或src。各种细胞类型试验中，在纳摩尔浓度下15也可阻断 EGF受体的自身磷酸化。15的类似物对ATP也显示竞争性抑制作用。15可作为EGFr抑制剂有价值的标准物。但15的水溶性较差，因此对于肿瘤模型的体内评价较为困难。Suqen的这一化合物（代号SU－ 5271）作为局部用银屑病治疗药，现处于Ⅰ期临床试验中。EGFr抑制剂可用于银屑病治疗是因为EGF 途径在角化细胞增殖时具有很重要的作用。
　　为改善水溶性较差的缺点，制备了含有碱性吗啉基丙基和二甲胺基丁基的行生物16和17。16抑制分离酶和EGF受体自身磷酸化的IC₅₀值分别为7.4和 38nmol/L，17为1.9nmo/L和8.1nmol／L。16和17 在裸鼠试验时能阻滞人体A431细胞异种移植肿瘤的生长。吡啶并嘧啶衍生物PD－158780（18）抑制 EGFr自身磷酸化的IC₅₀值为13nmof／L，在A431异种移植模型试验时能使肿瘤生长延迟8天；在MCF－7 细胞异种移植模型试验中能使肿瘤生长延迟15天。
　　上述化合物都是可逆性抑制剂，而不可逆抑制剂可以在更低浓度下阻断酶的细胞活性，为此 Parke－Day估公司发现，通过与受体中于靠近ATP结合部位的半胱氨酸残基共价结合，2-硫代腺苷能不可逆抑制EGFr和erbB－2。模型试验表明，利用上述发现制得的PD－168393（19），其丙烯酰胺基能与EGFr第773位半胱氨酸形成共价键，对分离酶的IC₅₀值为0.7nmol/L；而相应的丙酰胺基类似物 PD－174265（20）的IC₅₀值为0.45nmol／L。尽管 19和20体外活性相似，但20是可逆性抑制剂，体内活性低于不可逆抑制剂19。在A431肿瘤异种移植模型试验中，腹腔内注射19可使肿瘤生长延迟17 天，而20只能延迟2天。在异种移植模型试验中口服19也有活性。20分子中引入水溶性基团可提高体内活性。含有7-吗啉基丙氧基的PD－169540（21）在分离酶和自身磷酸化试验中的IC₅₀值分别为 3.6nmol／L和5.3nmol／L。在A431模型试验中，口服21 5mg／kg能有效抑制肿瘤生长。
　　含丁胺基的CL－387785（22）也是不可逆抑制剂，抑制EGFr酶活性和自身磷酸化的IC₅₀值分别为370ρmol／L和5nmol／L，在A431异种移植模型试验中口服给药有抑制作用。Zeneca公司开发了一种 ZD－1839（23），它对分离酶的IC₅₀值为20nmol／ L，在许多异种移植模型试验中日服均有活性，最近进入Ⅱ期临床，用于治疗非小细胞肺癌及胰腺癌。另一种喹唑啉衍生物CP－358774（24）抑制分离的EGFr 的IC₅₀为2nmol／L，在EGFr自身磷酸化试验时IC₅₀ 为20nmol／L，并能在培养试验时阻断入结肠癌细胞的生长。进一步研究表明，在细胞培养时和异种模型试验时均可抑制人头颈部肿瘤细胞系HN5的增殖。
　　Novartis公司根据4-苯胺基喹唑啉衍生物和另一些已知的ATP竞争性激酶抑制剂的活性设计了含有 EGFr ATP结合部位药效基团的模型，用它确认4-苯胺基-7H-吡咯并[2，3－d]嘧啶是一种强效EGFr的 ATP竞争性抑制剂。CGP－59326（25）对分离 EGFr的IC₅₀为27nmof／L，而相应的15的IC₅₀为 4nmol／L。在A431异种移植模型试验中每日口服25 盐酸盐可抑制肿瘤生长。

　　2 成纤维细胞生长因子FGF受体

　　 血管生成（或新血管形成）是肿瘤生长所必需的。抗新血管生成疗法与传统抗癌药物相比，其优点在于，前者针对的是遗传学稳定的内皮细胞，而后者的目标是不稳定的肿瘤细胞，这种方法可减少药物产生耐药性的可能性。天然的血管生成抑制剂如血管生成抑制因子（anqiostatin）和内皮生长抑制因子（endostatin）能明显抑制各种实体瘤增长，从而证实了通过阻断血流来抑制肿瘤增长的策略。另一种抗新血管生成的策略是阻断某些刺激血管生成的FGF和血管内皮生长因子（VEGF）等生长因子的作用。这些生长因子及其RTK的表达在血管生长时是正调节的。更多证据表明VEGF是血管生成的主要生长因子，FGF 在其中也起着重要的作用。
　　除血管生成外，FGF途径对动脉粥样硬化及再狭窄等血管增生也具有一定作用，对于肢体和骨骼形成也是必需的。目前FGF家族的18个成员对4种不同的FGFr TK有不同的亲和力。1997年Sugen报道了 FGFr－1与两个3-取代基二氢吲哚-2-酮共结晶的结晶结构。这是RTK与ATP竞争性抑制剂结合的晶体结构的首次报道。SU－4984（26）和SU－5402（27）对FGFr自身磷酸化的IC₅₀值为10－40μmol／［，但对EGFr无抑制作用。其后的研究表明27对PDGFr和 TK fik－1（VEGF的受体）的IC₅₀值分别为61μmol／ L和0.40μmol/L。但这些化合物体内无活性。
　　吡啶并[2；3－d]嘧啶的先导化合物PD－089828 （28）是几种TK的非选择性抑制剂，在分离酶试验中对FGFr、PDGFr、EGFr和src的IC₅₀分别为 0.15μml/L、1.76μmol/L、5.47μmol/L、 0.18μmol／L。此化合物是FGFr、PDGFr和EGFr 的ATP竞争性抑制剂，是src的非ATP竞争性抑制剂。28的衍生物PD－166866（29）是一种强的 FGFr选择性抑制剂，对FGFr的IC₅₀为60nmol／L，而对PDGFr、EGFr和sar的IC₅₀＞50μmol/L。FGFr 的自身磷酸化试验发现对于各种细胞类型29的IC₅₀ 值为10－20nmol／L，抑制FGF刺激细胞生长的IC₅₀ 值为24nmol／L，但对PDGF刺激细胞生长无作用。用人胎盘动脉的血管生成的体外模型试验，29抑制血管生成的IC₅₀值为470nmol/L。

　　3 血管内皮生长因子（VEGF）受体

　　 由于VEGF是对微血管通透性有影响的一种生长因子，因此最初命名为血管通透因子（VPF）。正由于这一附加特性，人们认为VEGF是最重要的血管生长因子。VEGF家族包括结合于RTK的四种蛋白，即flt- 1（VEGFr－1）、flk－1（KDR，VEGFr－2）和flt－4 （VEGFr－3），血管生成时关键的作用是VEGFr－1和 flk－1的相互作用。1993年Genentech公司发表过一种在体内抑制肿瘤生长的VEGF抗体，但在体外对肿瘤生长无抑制作用。此后又进行了其它几项VEGF抗体的研究，最近正在进行人源化抗体的临床研究。
　　已报道的flk－1小分子抑制剂是二叔丁基酚类似物SU－0879（30）、SU－1498（31）和SU－1433 （32），对flk-1自身磷酸化的IC₅₀值分别为0.8μ mol／L、07μmol／L和9.3μmol/L。这些化合物均不能抑制EGFr或erbB－2的自身磷酸化，32对 PDGFr自身磷酸化的IC₅₀值为5μmol／L。这三种化合物也能抑制胸着掺入到VEGF刺激的入脐静脉内皮细胞（HUVEC）的DNA中，在体内VEGF依赖性血管生成模型试验中31和32均能抑制血管形成。
　　最近发表了从FGFr抑制剂26和27衍生得到的新型flk－1抑制剂33，对flk-1、PDGFr、EGFr、 erbB－2和IGFr均有活性，但对FGFr没有活性。33 的类似物34和SU－5416（35）对flk－1自身磷酸化的IC₅₀值分别为0.14μmol/L和1.04μmol/L，对其它大多激酶无活性。35能抑制VEGF依赖性细胞的增殖，IC₅₀值分别为40－70nmol／L。此外，34还能有效地阻断裸鼠体内A375入黑素瘤异种移植物的生长，不久将进入Ⅱ期临床试验，用于实体瘤治疗。
　　近期，鉴定了在内皮细胞中表达并对血管生成很重要的TK受体第二个家族，Tie－1和Tie－2，尽管 Tie－1的配体还不清楚，但已知Tie－2（亦称Tek）能与血管生成素（angiopoietin）anq－1和ang－2结合。尚未报道Tie－1和Tie－2小分子抑制剂。

　　4 血小板衍生生长因子（PDGF）受体

　　 PDGF是一种强生长因子及平滑肌细胞（SMC）的化学引诱物。PDGF有三种不同的同工型，包括PDGF－A和PDGF－B多胜键的同或杂二聚物。PDGF受体也有PDGFr－α和PDGFr－β两型，与PDGF同工型的结合有不同的亲和力。PDGFr TK 与集落刺激因子受体（CSF－1r）、干细胞因子受体 c-kit结构有关。
　　血管成形术后冠状动脉再狭窄由多种因素造成，包括随着PDGF水平增加而增强SMC的增殖。PDGF 抑制剂能有效地治疗再狭窄，PDGF的抗体和 PDGF－β mRNA的反义寡核苷酸类均能降低大鼠颈动脉受到气囊损伤后产生的SMC迁移。此外， PDGFr－B链与猿癌蛋白v－sis有关，PDGF及其受体在某些类型人神经胶质瘤中过分表达，能抑制 PDGFr活性的小分子，用于抗癌治疗具有潜在的应用价值。
　　Rhone－Poulenc Rorer公司制备的多数酪氨酸磷酸化抑制剂的类似物是EGFr抑制剂。其后制备的类似物中活性最强的化合物为3－（3-噻吩）类似物 36和37，抑制PDGFr自身磷酸化的IC₅₀值分别为 1－20nmof／L和1－5nmol／L。1994年Levitzki等报道，环状酪氨酸磷酸化抑制剂能选择性抑制 PDGF，进一步研究发现活性最强的是AG－1296 （38）和AG－1295（39），IC₅₀值分别为800nmol/ L和400nmol/L。化合物38和39对EGFr或flk－1无活性，但可抑制另一些PDGFr家族成员如c－kit。38 是一种PDGFr酶的ATP竞争性抑制剂。细胞试验中 39抑制猪和人的SMC的生长以及动脉外植块的生长。若制成毫微粒制剂给药，可降低猪血管成形术模型气囊损伤后SMC的生长。
　　Novartis发表了一类结构不同的PDGFr抑制剂，2-苯胺基嘧啶衍生物中的CGP－53716（40）在酶试验中抑制PDGFr的IC₅₀值为100nmol／L，除了一种非受体TK abl之外，对其它许多激酶无抑制作用。40抑制PDGFr自身磷酸化的IC₅₀值为30－ 100nmol／L，它能阻断PDGF依赖性的生长，也能抑制由EGF和FGF介导的DNA合成，但不能阻断EGF 依赖性细胞的生长。使用V－sis转化细胞的异种移植模型试验显示，40有抗增殖活性，但在依赖EGF的 A431异种移植模型上未观察到作用。大鼠血管成形术模型试验中，40能在气囊损伤后减少SMC的生长。
　　40的类似物41和42抑制PDGFr的活性是40的 10倍，40进一步结构修饰后得到的CGP－57148 （43）抑制abl和PDGFr的IC₅₀值分别为38nmol/L 和50nmol／L，但对EGFr、Src或丝氨酸／苏氨酸激酶无活性。另一项研究发现，43抑制abl自身磷酸化的IC₅₀值为200nmol／L，并在体内和体外试验中阻止abl和sis转化细胞的生长。43用于慢性骨髓性白血病有潜在的治疗价值，此疾病时bcr－abl肿瘤基因过量表达。
　　CGP－52411是EGFr选择性抑制剂，而吲哚并咔唑衍生物3477W（44）则是一种PDGFr的选择性抑制剂。44在人血管平滑肌细胞（HVSMC）中测定的对PDGFr自身磷酸化的IC₅₀为14nmol/L，抑制PDGFr比抑制EGFr、abl或PKC β₂的活性高 1000倍。44在HVSMC试验时能抑制PDGF刺激的DNA的合成，但由于水溶性很差而不能进行体内试验。
　　2，6-二氯苯基吡啶并嘧啶本身是一个弱的非选择性TK抑制剂，但其伯胶基被苯胺基取代后大大提高了抑制活性，其中PD－166285（45）抑制 PDGFr、FGFr或src的IC₅₀值分别为79nmol／L、 43nmol／L和9nmol／L，抑制PDGFr自身磷酸化的IC₅₀ 值取决于细胞类型，约在1－5nmol/L范围内。在SK－ OV－3和HT－29两种异种移植模型试验中，口服45 的盐酸盐可使肿瘤生长延迟10天。
　　化合物46和47是45的类似物，46抑制PDGFr、 FGFr和src的IC₅₀值分别为31nmol／L、88nmol／L和 31nmol／L，而47分别为54nmol／L、2900nmol／L 和21onmol／L。46抑制PDGFr自身磷酸化的IC₅₀值为3nmol／L，在三种PDGF依赖性的肿瘤异种移植模型中能抑制肿瘤生长。
　　45的2－（4-氟苯胺基）衍生物PD－173956 （48）是一种src的强抑制剂。进入临床试验的 PDGFr抑制剂只有Suqen开发的来氟米特（leflunomide，49）。多年来Hoechst公司作为治疗类风湿性关节炎（RA）和移植物排斥的缓解剂进行了研究，最近FDA已批准用于治疗成人RA，商品名为Arava。49在体内迅速代谢为SU－20 （50），这是一种弱的EGFr和PDGFr自身磷酸化抑制剂（IC₅₀值为30－40μmol／L），另有一些研究发现50能抑制非受体TK src和Ick。Suqen认为 49不能抑制EGFr，但能抑制PDGFr和flt-1，IC₅₀ 值分别为65μmol／L和45μmol／L。由于49不能口服给药，口服给药会使其转化为50，而50不能抑制PDGFr自身磷酸化或PDGF依赖性细胞的生长。49 作为单一药物用于治疗成神经胶质细胞瘤已进入Ⅲ期临床。因为49能够增加细胞毒性药物卡莫司汀（carmustine）在入成神经胶质细胞瘤的异种移植模型试验中的疗效，计划进行49与卡莫司汀朕用的Ⅱ期临床研究。

　　5 集落刺激因子-1（CSF-1）受体

　　 CSF－1是一种单核细胞和巨噬细胞活化增殖的生长因子。CSF－1信号途径在癌症、炎症和动脉粥样硬化等各种疾病状态下起作用。Rhone－Ponlenc Rorer公司报道RPR－108514A（51）抑制CSF－ 1r的IC₅₀值为0.50μmol／L，而对EGFr和PDGFr 抑制作用很弱，IC₅₀值分别为4.0μmol／L和15.0μ mol/L。类似物52抑制CSF-1r的活性比51低10倍。活性最强的并具有选择性的是吡唑并嘧啶RPR－ 110993（53），研究显示其抑制CSF－1r的IC₅₀为 0.18μmol／L，对EGFr无活胜（IC₅₀＞50μmol／L）。

　　6 神经营养蛋白受体

　　 神经系统的发育和存活是依赖于神经生长因子（NGF）、神经营养因子和神经营养蛋白及其受体 trkA、trkB和trkC的相互作用。此外，trk通道在某些癌细胞，特别是胰腺癌和前列腺癌细胞的生长中起着一定的作用。
　　吲哚并咔唑生物碱K－252a（54）是包括PKC 激酶在内的一种丝氨酸／苏氨酸激酶抑制剂，以后又发现它能抑制TK的trk家族成员。日本协和发酵等发现类似物CEP－751（55）是活性最强的trk抑制剂， 100nmol／L可抑制所有三种trk受体的自身磷酸化，并且是一种trkA酶活性的ATP竞争性抑制剂，IC₅₀为 2.9nmol／L。但对于EGFr、1GF－1r或erbB－2无抑制活性，在较高剂量时能抑制PDGFr和FGFr受体的自身磷酸化。从trkA转染的细胞系得到的异种移植模型试验时发现，55具有治疗作用。大鼠前列腺癌模型试验，一日给予55 10mg／kg，28日后能完全抑制肿瘤生长。随后的研究表明，55在许多前列腺癌模型试验中均有治疗作用，但不影响正常的前列腺细胞或缺乏trk受体的癌细胞的生长。由于55的水溶性很差，已制备55的各种酯类前药，其赖氨酰β-丙氨酸酯即CEP－2563（56），有良好的水溶性和稳定性，据悉已进入Ⅰ期临床试验。
　　自1994年Parke－Davis公司首次发现PD－ 153035（15）以来，已报道了许多强的选择性的 RTK抑制剂。其中某些化合物正在进行临床研究以确定其抑制RTK的有效性以便用于各种疾病治疗。RTK 其他家族的小分子抑制剂，如胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、肝细胞生成因子受体和产红细胞生长素的肝细胞系受体（EPH）等尽管目前尚未发现，但今后应有可能得到。此外，作为药物开发目标的新的TK也是人们研究的方向。（王钢莲，陈本川）（国外医药2002第2期71页） }