神马文学网鱼类抗菌肽的研究进展
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山东省水产养殖病害防治中心 2008年12月11日
江丽娜1 赵瑞利1 雷连成1 王教玉2 韩文瑜1
1.吉林大学畜牧兽医学院 2.吉林省水产技术推广总站
在治疗高等动物发生的各种细菌性、病毒性疾病及其它病害中，由于大量使用抗生素，某些病原体对药物产生了耐药性，因而无法有效地控制疾病的发生。而筛选新的抗生素也极为困难，特别是人类真菌病害在当前仍是一个难以解决的问题。抗菌肽的发现，尤其是抗菌肽对耐药致病菌有良好的杀灭作用无疑为治疗这几类病害提供了新的途径。抗菌肽活性强、功能广泛，在应用研究中有重要价值，这个新领域引起了越来越多的研究者的关注。抗菌肽合成的速度非常快，与以恒定速度合成的肽键相比，抗菌肽的产生比IgM快100多倍，因此称抗菌肽是机体理想的第一道防线。到目前为止，多个鱼类抗菌肽基因不仅被分离下来，在活体内还对其进行了表达。
一、鱼类抗菌肽的生化特点和组成
鱼类抗菌肽是一类小分子蛋白质，其组成和结构复杂多样，分子量大小和氨基酸组成各不相同，但是他们根据一定的特点，例如含有较多的半胱氨酸，形成较保守的α-螺旋结构；含有较多的阳离子氨基酸例如精氨酸或赖氨酸而使分子带正电。根据其生化和结构特点，可将它们分为几种类型：
第一类，富含某种氨基酸的线性抗菌肽。此种类型的抗菌肽由于富含一些碱性氨基酸而带正电荷，在与细菌细胞膜相互作用时可以折叠成有利于穿膜的疏水或双亲性α-螺旋结构，能选择地作用于细菌外层细胞膜的某些组分，如带阴离子的磷脂，增大其渗透性而杀死或抑制细菌的生长。这类分子还包括来源于虹鳟血清的salmocidin；八目鳗小肠的HFIAPs(hag fish intestinal antimicrobial peptides)；分离自泥鳅的misgurin；来源于杂交斑纹鲈鱼皮肤、鳃和血液肥大细胞的piscidins以及分离自美洲拟鲽和豹鳎体表粘液的pleurocidins和pardaxins等，其中，由Brocal I，Falco A等人从刺泥鲽中的皮肤黏液中分离出一种25个氨基酸的线性抗菌肽Pleurocidin (Ple) ，具有与其他许多抗菌肽类似的两亲性α—螺旋结构鲈鱼的皮肤和腮可表达分泌moronecidin抗菌肽。鲈鱼moronecidins前体肽有79个氨基酸残基，由信号肽、成熟肽和C端pro片段3部分组成，氨基酸残基数分别为22、22和35。经圆二色谱分析其结构呈α-螺旋。
第二类，含多个半胱氨酸分子内形成环状抗菌肽这类抗菌肽由于含多个半胱氨酸而形成多个二硫键从而使其二级结构呈β折叠。这类分子包括来源于罗非鱼的hepcidin和从克海七鳃鳗的皮肤上分离到富含半胱氨酸和精氨酸的多肽LCRP(lamprey corticostatin-related peptide)等，其中hepcidin基因，大概含有20～25个氨基酸残基，内部有八个高度保守的半胱氨酸，形成四个分子内二硫键，它有三个外显子和两个内含子，其中有一个长为273bp的ORF顺序，编码一个含有90多个氨基酸残基的前多肽原，前多肽原包含三个区域，信号肽、成熟肽和由40个氨基酸残基构成的前hepcidin原，罗非鱼hepcidins类型目前报道有3种，分别命名为TH1-5、TH2-2和TH2-3，前体肽分别有88、86和91个氨基酸残基，相对分子质量分别对应为9.5、9.4和9.8 ku，三信号肽裂解位点分别位于第24～25、第22～23和第24～25密码子上，在共同的保守区域，都含有8个半胱氨基酸，罗非鱼中的TH2～3和日本鲽鱼的JF2相似，TH2-2和日本的JFl相似，TH1-5和鲷的hepcidin类似，通过晶体结构模型，表明，在半胱氨基酸部位都形成了二硫键，从斑马鱼分离的β-defensins有3种，分别命名为zfDB1、zfDB2和zfDB3。与哺乳动物β-defensins相同，三者的成熟肽都有6个半胱氨酸，形成3个二硫键，并且形成的模式一致，即第l～5、第2～4和第3～6个半胱氨酸。结构都呈β-折叠，但zfDB1的N端有一个α-螺旋结构。
第三类，组蛋白样抗菌肽(histone-like proteins，HLPs)。这类肽在水生动物中仅在鱼类中有发现，其它如虾类、贝类中尚未见报道。如从鲶、斑、斑纹鲈鱼、银大麻哈鱼和鲑等的皮肤粘液、鳃、血液和肝脏组织中分离的parasin I、HLPs和SAM等，氨基酸序列和质谱分析表明，它们与组蛋白H2A、H2B或Hl非常相似。从大西洋鲑皮肤黏液分离的SAMP H1(salmonantimicrobial peptide H1)含有30个氨基酸残基，中间富含Pro，N端乙酰基化，但对其抗菌活性没有影响，理论相对分子质量为2836u。经圆二色谱分析，其活性形式比非活性形式在分子结构上显得更紧凑和更具刚性。从鲋鱼红细胞上分离得到的一种特异的组蛋白H1与SAMP H1的氨基酸顺序有78％的同源性，有三个信号肽切割位点，是鲋鱼红细胞上一种新发现的抗菌肽。从鲶鱼受伤皮肤黏液分离得到的parasin I是由H2A组蛋白经酶cathepsin D在其N端Serl9-Arg20位置裂解作用后产生的一种抗菌肽。parasin I含有19个氨基酸残基，具有广谱抗菌活性。Jorge等从彩虹鲑鱼的皮肤分泌物中分离提取到了一种新的抗菌肽OncorhyncinⅡ，指出这种抗菌肽的前17个氨基酸残基与来自于彩虹鲑鱼组蛋白Hl的138～154个残基相同，并测得其分子量为719513Da。从而指出这OncorhyncinⅡ抗菌肽是组蛋白Hl的C末端69残基的片段。从鳕鱼(体表粘液中分离出来的几种抗菌抗菌活性因子，通过弱阳离子的交换色谱法和反相色谱层析技术，分离出来了三种小肽，通过N-端和C-端氨基酸顺序分析和质谱分析，它们分别为核糖肽类L40(6397Da)、L36A(12340Da)、L35(14215Da)。
第四类，经酰胺化、糖基化修饰的抗菌肽。这些肽由核糖体合成以后在高尔基体浓缩、加工时，在相关酶的作用下脱掉C-端一个或多个氨基酸，或再与一些糖基结合而变成有活性的成熟肽。这类肽在虾类和一些海水鱼类比较常见。如从健康的南美白对虾的血细胞和血浆中分离了几种抗菌活性因子，通过酶剪切、Edman降解、质谱仪分析等方法以及从血细胞的cDNA库中进行cDNA克隆，测定序列，发现南美白对虾抗菌肽penaeidins具有其中一种肽的N-端因形成焦谷氨酸而封闭；C-端由于谷氨酸在成熟肽中被去掉而酰胺化等等。但由于它们的N-端富含脯氨酸，而C-端含有由6个半胱氨酸组成的3个分子内二硫键，使它们的结构有别于其它类群的抗菌肽。还有从鲤体表粘液中分离的27KD疏水蛋白和从丁鲷和鳗鲡皮肤粘液中分离的分子量分别为65KD、49KD和45KD三种抗菌肽，也是经糖基化修饰的多肽。Jorge等从彩虹鲑鱼的皮肤中分离得到了一种新的具有抗菌功能的核糖肽类，测得其分子量大小为667616Da，并指出这种肽与40S的核糖体蛋白S30非常相似。Jorge等又从彩虹鲑鱼的血细胞中分离得到具有抗菌特性的活性片段，研究得出这种活性片段对热敏感且能被蛋白酶所消化，从而推断这一活性片段为一种类似蛋白质的具有抗菌性的天然成分。
二、鱼类抗菌肽的基因结构和功能
随着研究的深入，一些重要的抗菌肽基因正陆续被克隆。2006年中国水产科学研究院的刘碧莲等人根据GenBank中收录的鱼类抗菌肽hepcidin的cDNA序列设计特定的引物，用RT－PCR方法从从鳜鱼肝脏中克隆到hepcidin的cDNA，并构建Pmd18-Thepcidin载体进行序列测定和分析，结果表明，该cDNA长为38lbp，其中第20～277位该基因的开放阅读框(ORF)，编码86个氨基酸，形成由信号肽(24个残基)、前肽(42个残基)和成熟肽(20个残基)3部分序列组成的前体肽，与已报道的其他鲈形目鱼类hepcidin相比较，核苷酸序列的同源性为72.2％～92.0％，所推导的成熟肽与包括人类在内的其他生物的hepcidin成熟肽的同源性在50％～86.4％，Park等经质谱和化学分析方法研究正式，8个保守的cys残基间形成4个链内二硫键，分子呈发夹结构。4个链内二硫键可使β-折叠结构保持稳定。由Campagna S，Saint N等人2007年从条纹鲈鱼的肥大细胞里分离出了Piscidin抗菌肽，他们通过采用脂分子双层的结构分析和电生理实验研究了这个包括22个氨基酸残基的阳离子肽的抗菌机制，圆二色性实验发现piscidin在水中是无组织的但是却有一个高度紧密的alpha-helix，8-17个氨基酸残基在微胞的环境当中具有alpha-helix，由于有界限清楚的疏水和亲水的区域，这个分子有两亲性的特性。这种结构和那些能使细菌细胞膜通透性增加的阳离子肽的结构非常类似。Piscidin混合到偶氮植物凝血素二维的双分子层多通道实验发现在不同的浓度下会出现一个I-V曲线而且非常明确的表明肽分子能使细菌细胞膜通透。这个孔形成的活力通过单通道实验进一步证实了。离子通道的特性更加明确的表明了piscidin通过螺旋的孔道结构更能使细菌透化而不是通过“桶-桶板(barrel-stave)模型”。A．Falco等从鲑科EST数据库中调取了红鳟鱼β-防御素类抗菌肽的顺序称为c．mykiss β-defensin-1(omBD-1)，signal P 3.0 program分析发现，在omBD-1的的19位后有一个假定的切割位点，切割位点后有一个含有41个氨基酸的前体肽和β-防御素共有的顺序一样，也有6个保守的保守的cys残基，它和从其它鱼类中分离得到的β-防御素类抗菌肽有85.7％的同源性，同人类有34.9％的同源性，omBD-1有一个+2价的阳离子，等电点为8，这有助于omBD-l与细菌细胞膜的结合。
近年来的研究重点正在向建立水生动物免疫特异性cDNA文库和表达序列标签(ESTs)方面转移，这将有助于发现更多的抗菌肽基因。N a m等构建了日本鲽类鱼的cDNA和ESTs文库，从中鉴定了许多免疫相关基因，如Mx蛋白基因、补体基因、干扰素调节基因等；从两种白对虾的ESTs库中，发现了44个免疫功能相关基因，全部免疫ESTs中，属于抗菌肽的ESTs数量占总量的60％以上。由此可见抗菌肽的种类数目非常庞大，在水生动物中的分布也十分广泛。
三、鱼类抗菌肽的生物学活性与功能
鱼类抗菌肽是鱼体非特异性免疫系统的重要组成部分，当鱼体受到损伤或病原微生物侵袭时，能迅速产生抗菌肽以预防和杀伤病原微生物的入侵，其合成速度快，在体内扩散迅速、灵活的特点是其他大分子蛋白质(如抗体等)和免疫细胞所不具备的。随着经济和社会的发展，细菌和病毒对水产养殖的影响越来越严重，而且没有一种有效的治疗试剂来抑制鱼体病原菌的感染，抗菌肽的鉴定和特点受到水产养殖业的重视。编码Ple前肽原的基因组顺序已经从刺泥鲽中分离下来，在无病毒启动子的控制下成功克隆到了载体上，通过这种结构，生物活性的Ple转化到鱼体细胞株上，并持续增长了连续两年多。而且，对于Ple处理加工，成熟，分泌(通过使用绿色荧光蛋白融合技术)的研究，分泌的重组Ple抗菌肽具有很高的抗菌活性(在未经过浓缩的细胞悬浮液中发现)，在此之前，没有别的重组Ple抗菌肽或鱼体抗菌肽表达到这种程度。这样一个重组Ple抗菌肽或其它相关抗菌肽的过度表达可能会提高发现新的抗菌药物的机会。张宁应用分子生物学手段和生物信息学手段，通过化学合成从海马体内得到了足量的抗菌肽HKPLP．HKPLP对l0种人和鱼类致病菌或条件致病菌株的活性实验表明，HKPLP对大多数的Gram<+>菌和Gram<－>菌都敏感，其最小抑菌浓度(MIC)大多不超过16μg/ml，对白色念珠菌的MIC为32μg/ml，对铜绿假单胞菌、副溶血弧菌和鳗弧菌等三种鱼类致病菌的作用较弱，尽管HKPLP对人红细胞有一定的溶血活性，但在对大多数测试菌株有效的抑菌浓度下，溶血活性不超过20％。此外，还发现HKPLP对Hela、U25l和C6等几种癌细胞有显著的细胞毒作用，IC<50>为18～40μg/ml，而且该作用发生迅速，可能与海马的抗肿瘤活性有关。
Pan CY，Chen JY等人从鲈鱼鳃中分离得到的Epinecidin-1抗菌肽。鲈鱼epinecidin-l的多克隆免疫组织化学分析表明这种抗菌肽和它的抗体局限分布于鳃和小肠内。鲈鱼的两个合成肽g-ple 22-5l and g-ple 22-42对对革兰氏阳性细菌(如B. subtilis；S．aureus和P．putida)和革兰氏阴性细菌(如E. coli；S. typhimurum和serratia Sp)真菌(C. albicans;C. neoformans和S. cerevisiae)都表现了强烈的抗菌活性，除此之外，在鲈鱼和罗非鱼体内注射弧菌属vulnificus后抗菌肽通过处理能够显著增加鱼的生存量，这些结果对于研制鱼类病原菌感染的预防剂和治疗剂提供了一定的依据特别是对鱼类的细菌感染中的免疫缺陷起到了改善的作用。生长于极地海洋环境的鱼类其血清具有高水平的抗冻蛋白(AFP)或抗冻糖蛋白(AFGP)，能通过阻止冰晶的形成而降低结冰温度，它成为第二个常用的外源基因，通过转AFP基因以提高受体鱼的抗冻能力在鲽形目中发现了分子量较大的抗菌肽，它们具有相似的结构特征，均富含丙氨酸和α螺旋结构，此分子的发现和对其结构与功能的深入研究将可促进转抗冻蛋白基因鱼类的研制进程。
四、抗菌肽在水产养殖上的应用前景
随着人口的增加和工农业生产的迅猛发展，全球性的环境污染日益加重，水环境出现了有机物和无机物富营养化、重金属离子和某些难降解的农药、有害化学成分富集等现象。同时养殖生产过程中产生的排泄物和残饵等超过了水环境的自净能力，进一步加剧了水环境的污染程度，因而使水产养殖品种频频发生各种细菌性和病毒性疾病。防治过程大量地使用抗生素或其它药物，破坏了水环境的微生态平衡，某些病原体对药物产生了耐药性，因而无法有效地控制疾病的发生。由于缺乏有效的防治措施，严重地制约着水产养殖业的发展。因此，加快对主要水产养殖品种免疫防御的基础研究，调动、开发其自身的防御潜力，是开展健康养殖、实现养殖业可持续发展的重要战略之一。水产动物抗菌肽的研究加深了人们对低等脊椎动物免疫防御机制的认识，为日益严重的鱼类病害防治开辟了崭新的途径。同时随着转基因技术的发展，人们有可能通过转抗菌肽基因获得抗病新品种。有理由相信，随着研究的不断深入，水产动物抗菌肽将对世界水产业的可持续发展起到重要的作用。
五、展望
随着人们对水产动物各种抗菌肽的分离、结构和功能的研究，改造并合成既有稳定高效抗菌活性又具特异抗菌谱且同时对宿主无害的抗菌肽基因，并通过基因工程进行表达，实现批量生产，是人们研究的热点和重点。目前，国内外养殖业和饲料加工发展很快，抗菌肽作为新型饲料添加剂具有极大的开发潜力和应用前景。通过移植功能强大的抗菌肽基因获得转基因鱼、虾类抗病品种，通过提高其自身的免疫能力增强抗病力，应是完全可行和有效的。
（信息来源：《中国水产》2008.5）
江丽娜1 赵瑞利1 雷连成1 王教玉2 韩文瑜1
1.吉林大学畜牧兽医学院 2.吉林省水产技术推广总站
在治疗高等动物发生的各种细菌性、病毒性疾病及其它病害中，由于大量使用抗生素，某些病原体对药物产生了耐药性，因而无法有效地控制疾病的发生。而筛选新的抗生素也极为困难，特别是人类真菌病害在当前仍是一个难以解决的问题。抗菌肽的发现，尤其是抗菌肽对耐药致病菌有良好的杀灭作用无疑为治疗这几类病害提供了新的途径。抗菌肽活性强、功能广泛，在应用研究中有重要价值，这个新领域引起了越来越多的研究者的关注。抗菌肽合成的速度非常快，与以恒定速度合成的肽键相比，抗菌肽的产生比IgM快100多倍，因此称抗菌肽是机体理想的第一道防线。到目前为止，多个鱼类抗菌肽基因不仅被分离下来，在活体内还对其进行了表达。
一、鱼类抗菌肽的生化特点和组成
鱼类抗菌肽是一类小分子蛋白质，其组成和结构复杂多样，分子量大小和氨基酸组成各不相同，但是他们根据一定的特点，例如含有较多的半胱氨酸，形成较保守的α-螺旋结构；含有较多的阳离子氨基酸例如精氨酸或赖氨酸而使分子带正电。根据其生化和结构特点，可将它们分为几种类型：
第一类，富含某种氨基酸的线性抗菌肽。此种类型的抗菌肽由于富含一些碱性氨基酸而带正电荷，在与细菌细胞膜相互作用时可以折叠成有利于穿膜的疏水或双亲性α-螺旋结构，能选择地作用于细菌外层细胞膜的某些组分，如带阴离子的磷脂，增大其渗透性而杀死或抑制细菌的生长。这类分子还包括来源于虹鳟血清的salmocidin；八目鳗小肠的HFIAPs(hag fish intestinal antimicrobial peptides)；分离自泥鳅的misgurin；来源于杂交斑纹鲈鱼皮肤、鳃和血液肥大细胞的piscidins以及分离自美洲拟鲽和豹鳎体表粘液的pleurocidins和pardaxins等，其中，由Brocal I，Falco A等人从刺泥鲽中的皮肤黏液中分离出一种25个氨基酸的线性抗菌肽Pleurocidin (Ple) ，具有与其他许多抗菌肽类似的两亲性α—螺旋结构鲈鱼的皮肤和腮可表达分泌moronecidin抗菌肽。鲈鱼moronecidins前体肽有79个氨基酸残基，由信号肽、成熟肽和C端pro片段3部分组成，氨基酸残基数分别为22、22和35。经圆二色谱分析其结构呈α-螺旋。
第二类，含多个半胱氨酸分子内形成环状抗菌肽这类抗菌肽由于含多个半胱氨酸而形成多个二硫键从而使其二级结构呈β折叠。这类分子包括来源于罗非鱼的hepcidin和从克海七鳃鳗的皮肤上分离到富含半胱氨酸和精氨酸的多肽LCRP(lamprey corticostatin-related peptide)等，其中hepcidin基因，大概含有20～25个氨基酸残基，内部有八个高度保守的半胱氨酸，形成四个分子内二硫键，它有三个外显子和两个内含子，其中有一个长为273bp的ORF顺序，编码一个含有90多个氨基酸残基的前多肽原，前多肽原包含三个区域，信号肽、成熟肽和由40个氨基酸残基构成的前hepcidin原，罗非鱼hepcidins类型目前报道有3种，分别命名为TH1-5、TH2-2和TH2-3，前体肽分别有88、86和91个氨基酸残基，相对分子质量分别对应为9.5、9.4和9.8 ku，三信号肽裂解位点分别位于第24～25、第22～23和第24～25密码子上，在共同的保守区域，都含有8个半胱氨基酸，罗非鱼中的TH2～3和日本鲽鱼的JF2相似，TH2-2和日本的JFl相似，TH1-5和鲷的hepcidin类似，通过晶体结构模型，表明，在半胱氨基酸部位都形成了二硫键，从斑马鱼分离的β-defensins有3种，分别命名为zfDB1、zfDB2和zfDB3。与哺乳动物β-defensins相同，三者的成熟肽都有6个半胱氨酸，形成3个二硫键，并且形成的模式一致，即第l～5、第2～4和第3～6个半胱氨酸。结构都呈β-折叠，但zfDB1的N端有一个α-螺旋结构。
第三类，组蛋白样抗菌肽(histone-like proteins，HLPs)。这类肽在水生动物中仅在鱼类中有发现，其它如虾类、贝类中尚未见报道。如从鲶、斑、斑纹鲈鱼、银大麻哈鱼和鲑等的皮肤粘液、鳃、血液和肝脏组织中分离的parasin I、HLPs和SAM等，氨基酸序列和质谱分析表明，它们与组蛋白H2A、H2B或Hl非常相似。从大西洋鲑皮肤黏液分离的SAMP H1(salmonantimicrobial peptide H1)含有30个氨基酸残基，中间富含Pro，N端乙酰基化，但对其抗菌活性没有影响，理论相对分子质量为2836u。经圆二色谱分析，其活性形式比非活性形式在分子结构上显得更紧凑和更具刚性。从鲋鱼红细胞上分离得到的一种特异的组蛋白H1与SAMP H1的氨基酸顺序有78％的同源性，有三个信号肽切割位点，是鲋鱼红细胞上一种新发现的抗菌肽。从鲶鱼受伤皮肤黏液分离得到的parasin I是由H2A组蛋白经酶cathepsin D在其N端Serl9-Arg20位置裂解作用后产生的一种抗菌肽。parasin I含有19个氨基酸残基，具有广谱抗菌活性。Jorge等从彩虹鲑鱼的皮肤分泌物中分离提取到了一种新的抗菌肽OncorhyncinⅡ，指出这种抗菌肽的前17个氨基酸残基与来自于彩虹鲑鱼组蛋白Hl的138～154个残基相同，并测得其分子量为719513Da。从而指出这OncorhyncinⅡ抗菌肽是组蛋白Hl的C末端69残基的片段。从鳕鱼(体表粘液中分离出来的几种抗菌抗菌活性因子，通过弱阳离子的交换色谱法和反相色谱层析技术，分离出来了三种小肽，通过N-端和C-端氨基酸顺序分析和质谱分析，它们分别为核糖肽类L40(6397Da)、L36A(12340Da)、L35(14215Da)。
第四类，经酰胺化、糖基化修饰的抗菌肽。这些肽由核糖体合成以后在高尔基体浓缩、加工时，在相关酶的作用下脱掉C-端一个或多个氨基酸，或再与一些糖基结合而变成有活性的成熟肽。这类肽在虾类和一些海水鱼类比较常见。如从健康的南美白对虾的血细胞和血浆中分离了几种抗菌活性因子，通过酶剪切、Edman降解、质谱仪分析等方法以及从血细胞的cDNA库中进行cDNA克隆，测定序列，发现南美白对虾抗菌肽penaeidins具有其中一种肽的N-端因形成焦谷氨酸而封闭；C-端由于谷氨酸在成熟肽中被去掉而酰胺化等等。但由于它们的N-端富含脯氨酸，而C-端含有由6个半胱氨酸组成的3个分子内二硫键，使它们的结构有别于其它类群的抗菌肽。还有从鲤体表粘液中分离的27KD疏水蛋白和从丁鲷和鳗鲡皮肤粘液中分离的分子量分别为65KD、49KD和45KD三种抗菌肽，也是经糖基化修饰的多肽。Jorge等从彩虹鲑鱼的皮肤中分离得到了一种新的具有抗菌功能的核糖肽类，测得其分子量大小为667616Da，并指出这种肽与40S的核糖体蛋白S30非常相似。Jorge等又从彩虹鲑鱼的血细胞中分离得到具有抗菌特性的活性片段，研究得出这种活性片段对热敏感且能被蛋白酶所消化，从而推断这一活性片段为一种类似蛋白质的具有抗菌性的天然成分。
二、鱼类抗菌肽的基因结构和功能
随着研究的深入，一些重要的抗菌肽基因正陆续被克隆。2006年中国水产科学研究院的刘碧莲等人根据GenBank中收录的鱼类抗菌肽hepcidin的cDNA序列设计特定的引物，用RT－PCR方法从从鳜鱼肝脏中克隆到hepcidin的cDNA，并构建Pmd18-Thepcidin载体进行序列测定和分析，结果表明，该cDNA长为38lbp，其中第20～277位该基因的开放阅读框(ORF)，编码86个氨基酸，形成由信号肽(24个残基)、前肽(42个残基)和成熟肽(20个残基)3部分序列组成的前体肽，与已报道的其他鲈形目鱼类hepcidin相比较，核苷酸序列的同源性为72.2％～92.0％，所推导的成熟肽与包括人类在内的其他生物的hepcidin成熟肽的同源性在50％～86.4％，Park等经质谱和化学分析方法研究正式，8个保守的cys残基间形成4个链内二硫键，分子呈发夹结构。4个链内二硫键可使β-折叠结构保持稳定。由Campagna S，Saint N等人2007年从条纹鲈鱼的肥大细胞里分离出了Piscidin抗菌肽，他们通过采用脂分子双层的结构分析和电生理实验研究了这个包括22个氨基酸残基的阳离子肽的抗菌机制，圆二色性实验发现piscidin在水中是无组织的但是却有一个高度紧密的alpha-helix，8-17个氨基酸残基在微胞的环境当中具有alpha-helix，由于有界限清楚的疏水和亲水的区域，这个分子有两亲性的特性。这种结构和那些能使细菌细胞膜通透性增加的阳离子肽的结构非常类似。Piscidin混合到偶氮植物凝血素二维的双分子层多通道实验发现在不同的浓度下会出现一个I-V曲线而且非常明确的表明肽分子能使细菌细胞膜通透。这个孔形成的活力通过单通道实验进一步证实了。离子通道的特性更加明确的表明了piscidin通过螺旋的孔道结构更能使细菌透化而不是通过“桶-桶板(barrel-stave)模型”。A．Falco等从鲑科EST数据库中调取了红鳟鱼β-防御素类抗菌肽的顺序称为c．mykiss β-defensin-1(omBD-1)，signal P 3.0 program分析发现，在omBD-1的的19位后有一个假定的切割位点，切割位点后有一个含有41个氨基酸的前体肽和β-防御素共有的顺序一样，也有6个保守的保守的cys残基，它和从其它鱼类中分离得到的β-防御素类抗菌肽有85.7％的同源性，同人类有34.9％的同源性，omBD-1有一个+2价的阳离子，等电点为8，这有助于omBD-l与细菌细胞膜的结合。
近年来的研究重点正在向建立水生动物免疫特异性cDNA文库和表达序列标签(ESTs)方面转移，这将有助于发现更多的抗菌肽基因。N a m等构建了日本鲽类鱼的cDNA和ESTs文库，从中鉴定了许多免疫相关基因，如Mx蛋白基因、补体基因、干扰素调节基因等；从两种白对虾的ESTs库中，发现了44个免疫功能相关基因，全部免疫ESTs中，属于抗菌肽的ESTs数量占总量的60％以上。由此可见抗菌肽的种类数目非常庞大，在水生动物中的分布也十分广泛。
三、鱼类抗菌肽的生物学活性与功能
鱼类抗菌肽是鱼体非特异性免疫系统的重要组成部分，当鱼体受到损伤或病原微生物侵袭时，能迅速产生抗菌肽以预防和杀伤病原微生物的入侵，其合成速度快，在体内扩散迅速、灵活的特点是其他大分子蛋白质(如抗体等)和免疫细胞所不具备的。随着经济和社会的发展，细菌和病毒对水产养殖的影响越来越严重，而且没有一种有效的治疗试剂来抑制鱼体病原菌的感染，抗菌肽的鉴定和特点受到水产养殖业的重视。编码Ple前肽原的基因组顺序已经从刺泥鲽中分离下来，在无病毒启动子的控制下成功克隆到了载体上，通过这种结构，生物活性的Ple转化到鱼体细胞株上，并持续增长了连续两年多。而且，对于Ple处理加工，成熟，分泌(通过使用绿色荧光蛋白融合技术)的研究，分泌的重组Ple抗菌肽具有很高的抗菌活性(在未经过浓缩的细胞悬浮液中发现)，在此之前，没有别的重组Ple抗菌肽或鱼体抗菌肽表达到这种程度。这样一个重组Ple抗菌肽或其它相关抗菌肽的过度表达可能会提高发现新的抗菌药物的机会。张宁应用分子生物学手段和生物信息学手段，通过化学合成从海马体内得到了足量的抗菌肽HKPLP．HKPLP对l0种人和鱼类致病菌或条件致病菌株的活性实验表明，HKPLP对大多数的Gram<+>菌和Gram<－>菌都敏感，其最小抑菌浓度(MIC)大多不超过16μg/ml，对白色念珠菌的MIC为32μg/ml，对铜绿假单胞菌、副溶血弧菌和鳗弧菌等三种鱼类致病菌的作用较弱，尽管HKPLP对人红细胞有一定的溶血活性，但在对大多数测试菌株有效的抑菌浓度下，溶血活性不超过20％。此外，还发现HKPLP对Hela、U25l和C6等几种癌细胞有显著的细胞毒作用，IC<50>为18～40μg/ml，而且该作用发生迅速，可能与海马的抗肿瘤活性有关。
Pan CY，Chen JY等人从鲈鱼鳃中分离得到的Epinecidin-1抗菌肽。鲈鱼epinecidin-l的多克隆免疫组织化学分析表明这种抗菌肽和它的抗体局限分布于鳃和小肠内。鲈鱼的两个合成肽g-ple 22-5l and g-ple 22-42对对革兰氏阳性细菌(如B. subtilis；S．aureus和P．putida)和革兰氏阴性细菌(如E. coli；S. typhimurum和serratia Sp)真菌(C. albicans;C. neoformans和S. cerevisiae)都表现了强烈的抗菌活性，除此之外，在鲈鱼和罗非鱼体内注射弧菌属vulnificus后抗菌肽通过处理能够显著增加鱼的生存量，这些结果对于研制鱼类病原菌感染的预防剂和治疗剂提供了一定的依据特别是对鱼类的细菌感染中的免疫缺陷起到了改善的作用。生长于极地海洋环境的鱼类其血清具有高水平的抗冻蛋白(AFP)或抗冻糖蛋白(AFGP)，能通过阻止冰晶的形成而降低结冰温度，它成为第二个常用的外源基因，通过转AFP基因以提高受体鱼的抗冻能力在鲽形目中发现了分子量较大的抗菌肽，它们具有相似的结构特征，均富含丙氨酸和α螺旋结构，此分子的发现和对其结构与功能的深入研究将可促进转抗冻蛋白基因鱼类的研制进程。
四、抗菌肽在水产养殖上的应用前景
随着人口的增加和工农业生产的迅猛发展，全球性的环境污染日益加重，水环境出现了有机物和无机物富营养化、重金属离子和某些难降解的农药、有害化学成分富集等现象。同时养殖生产过程中产生的排泄物和残饵等超过了水环境的自净能力，进一步加剧了水环境的污染程度，因而使水产养殖品种频频发生各种细菌性和病毒性疾病。防治过程大量地使用抗生素或其它药物，破坏了水环境的微生态平衡，某些病原体对药物产生了耐药性，因而无法有效地控制疾病的发生。由于缺乏有效的防治措施，严重地制约着水产养殖业的发展。因此，加快对主要水产养殖品种免疫防御的基础研究，调动、开发其自身的防御潜力，是开展健康养殖、实现养殖业可持续发展的重要战略之一。水产动物抗菌肽的研究加深了人们对低等脊椎动物免疫防御机制的认识，为日益严重的鱼类病害防治开辟了崭新的途径。同时随着转基因技术的发展，人们有可能通过转抗菌肽基因获得抗病新品种。有理由相信，随着研究的不断深入，水产动物抗菌肽将对世界水产业的可持续发展起到重要的作用。
五、展望
随着人们对水产动物各种抗菌肽的分离、结构和功能的研究，改造并合成既有稳定高效抗菌活性又具特异抗菌谱且同时对宿主无害的抗菌肽基因，并通过基因工程进行表达，实现批量生产，是人们研究的热点和重点。目前，国内外养殖业和饲料加工发展很快，抗菌肽作为新型饲料添加剂具有极大的开发潜力和应用前景。通过移植功能强大的抗菌肽基因获得转基因鱼、虾类抗病品种，通过提高其自身的免疫能力增强抗病力，应是完全可行和有效的。
（信息来源：《中国水产》2008.5）