大菱鲆出血性败血症病原茵的分离与鉴定

大菱鲆出血性败血症病原茵的分离与鉴定 
于兰萍， 王 斌， 李 艳， 胡 亮， 赵凤梅
(大连水产学院农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室，i／．宁大连116023)
摘要：从全身呈弥漫性出血的养殖大菱鲆Scophthalmus maximus肝脏、腹水和肾脏中分离到3株菌落形态
相同的优势菌，取菌株L一59231通过注射(菌液浓度分别为4×10。、5×10 cfu／mL，剂量0．1 mL／尾)、
灌喂(4×lOG cfu／mL，0．5 mL／尾)和创伤浸泡(4．7×10 cfu／mL)三种途径对大菱鲆进行人工感染试验。
结果表明：以上三种途径均可造成大菱鲆的发病，灌喂感染和创伤浸泡对试验鱼的感染率为100％ 和
57．1％ ，未发现死亡；注射感染的死亡率分别为100％和71．4％ 。药敏试验表明，庆大霉索、四环索、氯
霉素、红霉素、链霉素等对L一59231菌株有较强的抑制作用。该菌呈短杆状，革兰氏染色阴性，氧化酶阳
性，接触酶阴性，V—P试验阴性，硝酸盐还原反应阳性。根据《常见细菌系统鉴定手册》所描述的弧菌
属的生理生化特性，综合形态观察、生理生化特征、16S rRNA基因序列等试验结果，可将L一59231菌株
鉴定为创伤弧菌。
关键词：大菱鲆；细菌鉴定；创伤弧菌；感染试验
中图分类号：$941．42 文献标志码：A
大菱鲆Scophthalmus maximus是近年来中国引
进的一个优良海水养殖种类，经济价值高，在北方
沿海地区养殖较为普遍。随着现代集约化高密度养
殖规模的扩大，大菱鲆的病害日益严重，给养殖业
造成巨大的经济损失¨I2 J。创伤弧菌是弧菌属中一
种人畜共患病菌，经口和创伤感染后，可引起胃肠
道疾患，严重者可发生败血症 J。1989年首次在
欧洲养殖鳗鲡中分离到创伤弧菌，并导致大量欧洲
鳗鲡养殖场倒闭破产 J。创伤弧菌菌体内的内毒
素对于牙鲆鱼体会产生较大的毒性作用，甚至造成
个别鱼苗死亡 J。目前创伤弧菌对大菱鲆的致病
性国内尚未见报道。本试验中，作者从患病大菱鲆
体内分离可疑病原进行人工感染试验，确定其病原
性，并对病原菌进行分类鉴定，旨在探索对该病的
有效防治方法。
1 材料与方法
1．1 材料
病鱼取自旅顺北海一养殖场，全长为l0一l5
cm。健康大菱鲆购于大连旅顺双龙水产公司，在
水槽中(18℃)暂养1个月，投喂鲜活小杂鱼。
细菌分离采用2216E海水培养基_7 J：酵母膏
1．0 g，蛋白胨5．0 g，FePO 0．01 g，琼脂15 g，用
陈海水定容至1 000 mL，pH为7．6—7．8。生理生
化试验所用培养基的配制参见文献[8]。
1．2 方法
I．2．1 病原茵的分离与纯化观察不同发病程度
个体的体征及器官损坏情况。取发病症状典型的濒
死病鱼，用体积分数为70％的酒精棉球反复擦拭
消毒病鱼的腹部和体表，采用两种方法分离细菌：
1)用无菌注射器刺人病鱼腹腔内，抽取腹水，滴
于2216E平板上，然后用接种环划线分离；2)无
菌操作下打开腹腔，用接种环刺人病鱼肝脏和肾脏
内，分别划线接种于2216E平板上。平板于25℃
下恒温培养24 h；挑取形态特征一致的优势菌落进
行纯化培养，转接2216E斜面，于l5℃下保存备
用。
1．2．2 人工感染试验 1)菌悬液的制备 试验
用菌株于25℃下培养24 h，用无菌生理盐水冲洗，
制备菌悬液。用平板菌落计数法计数，并将细菌浓
度调至为4×10 cfu／mL。
2)感染试验试验在150 L白色塑料箱中进
行。每箱放健康大菱鲆7尾，平均体长为(12±
2)cm，水温为18℃。用分离的菌株L一59231对
健康大菱鲆进行注射、灌喂两种途径感染。
注射感染共分两组。于背鳍基部分别注射浓
度为4×10 cfu／mL(A组)和5×10 cfu／mL(B
组)的菌液，0．1 mL／尾。对照组鱼注射同体积的
灭菌生理盐水。
灌喂感染用长滴管将菌液注入口腔，菌液浓
度为4×10 cfu／mL，0．5 mL／尾，每隔一天进行1
次，共灌喂4次。对照组鱼灌喂同体积的灭菌生理
盐水。
创伤浸泡感染 将7尾试验鱼的背部刮伤
(面积约1．0～1．5 cm )后，放人有少量海水的水
桶中，加入菌液至终浓度为4．7×10 cfu／mL，浸
泡20 min后移人水槽常规饲养；对照组鱼采用相
同方法处理后，放人生理盐水中浸泡20 min后移
入水槽常规饲养。
1．2．3 病原菌的鉴定将经感染试验证实具病原
性的L一59231菌株接种于2216E斜面，于25℃下
培养24 h，用革兰氏染色观察形态；用半固体
2216E穿刺接种培养和水浸片结合观察细菌的运动
性；接种于2216E平板上，于25℃ 下培养48 h，
观察菌落的形态及大小。按《常见细菌系统分类
手册》LS J所述方法鉴定到种。
1．2．4 16S rDNA基因序列的PCR扩增与测序
挑取单菌落置于10 L灭菌水中，99℃下裂解细
菌，以3 500 r／min离心10 rain，取上清液作为模
板，使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification
PCR Kit(Code No．D310)，以Forward primer／Reverse
primer 2为引物，扩增目的片段。以Seq Forward
为引物对回收产物进行DNA测序，Seq For．
ward的引物序列为5 CAGCGGATAACAA1] CACA—
CAGG3 (购自大连宝生物工程有限公司)。
I．2．5 抗生素敏感试验采用纸片扩散法。取确
定病原的菌株L一59231，用无菌生理盐水从培养
24 h的2216E斜面上洗脱制成菌悬液，各取0．1
mL等量涂布于多个2216E平板上进行药敏试验。
每一平板放4片药敏纸片，药物有庆大霉素、四环
素、氯霉素等1O种，于恒温箱(25℃)中培养
24 h后测量抑菌圈直径。
2 结果
2．1 病鱼体征及细菌分离结果
患病鱼全身体表具弥漫性出血点，毛细血管扩
张充盈，腹部膨出，内有淡黄色腹水。症状严重者
肝脏苍白易碎，肠壁上可见出血点，肠腔中有少量
自便。从患病鱼腹水、肝脏和肾脏中分离出3株优
势菌，编号为L一49231、L一59231和L一59232。
3株菌菌落形态基本相同，为乳白色，半透明，直
径1 mm左右。将菌株(L一59231)在2216E平板
上培养48 h，其菌落形态呈圆形，半透明，隆起，
边缘整齐，直径为1．2 1Tim左右。
2．2 感染试验结果
2．2．1 注射感染 注射4×10 cfu／mL L一59231
菌液的试验鱼(A组)，试验第6天开始出现症
状，注射处突出发白，但不是很明显，未见明显出
血倾向；试验第9天，试验鱼开始死亡，死亡前鱼
体征为鳍发红严重，全身有散在出血点，解剖可见
肝脏充血、易碎，肠肿胀、肠壁充血，偶见腹水；
至第l9天试验鱼全部死亡。注射5×10 cfu／mL
L一59231菌液的试验鱼(B组)，试验第11天开
始出现死亡，至第21天死亡5尾，试验结束时死
亡率为71．4％ ，症状体征与A组鱼相同，解剖剩
余的2尾，可见与死鱼同样的体征(表1)。
表1 注射感染的试验结果
Tab．1 Intramuscular challenge of turbot Scophthalmus maxiraus with V／br／o vulnificus strain L-59231
2．2．2 灌喂感染试验鱼在第10天出现症状，嘴
部、各鳍基部均充血发红，活力下降。在停止灌喂
后第4天，鱼活力逐渐恢复，症状逐渐减轻至不明
显。直至第15天无死亡，感染率为100％ (表2)。
2．2．3 创伤浸泡感染 感染组在第4天开始出现
刮伤处发红。至第21天，创伤发红处没有愈合的
迹象，出现的溃烂症状加重，感染率达到57．1％
(表2)。通过三种感染途径死亡及感染的鱼体内均
可再次分离到与原菌株相同形态的菌落。
第5期 于兰萍，等：大菱鲆出血性败血症病原菌的分离与鉴定 337
表2 灌喂感染和创伤浸泡感染的试验结果
Tab．2 Oral and marinating challenge of turbot Scophthalmus maximus witII Vibrio vulnificus strain L一59231
注：每组试验鱼为7尾。
2．3 病原菌的鉴定
菌株L一59231呈短杆状，运动性不强，革兰
氏染色阴性；在4、15、25、3O、35℃ 下生长，在
40℃ 下不生长；能利用柠檬酸盐、D一甘露糖、麦
芽糖和D一半乳糖，不能利用乳糖、蔗糖、D一山
梨醇和赖氨酸。菌株L一59231的生化指标特性
(表3)与《常见细菌系统鉴定手册》中创伤弧菌
的生化指标基本相符。
表3 L一59231菌株的生化特征
Tab．3 The biochemical characteristics of V／br／o vulniftcus
strrdn L一5923l
检测项目item 结果result
氧化酶oxidase
接触酶catalase
运动性motility
吲哚产生indol test
甲基红试验methyl red test
V—P试验voges—prokauertest
三糖铁H2s产生H2S production
精氨酸双水解酶arginine dihydrolase
明胶水解(2O℃)gelatinase(20℃)
淀粉酶amylase
脂酶lipase
葡萄糖氧化发酵oxidation and fermentation of gluco~
硝酸盐还原nitrate reduction
从D一葡萄糖产气gasfrom D—gluco~
生长需要NaC1 growth in NaC1
乳糖发酵fermentation of lactose
O／129 (10 tg／片)O／129(10 g／piece)
O／129 (150 g／片)O／129 (150 g／piece)
注： 一示反应阴性；+示反应阳性；S示敏感；F示发酵型。
2．4 药敏试验结果
从表4可见：菌株L一59231对红霉素、链霉
素、庆大霉素、四环素、氯霉素敏感，对呋喃妥
因、青霉素、氟哌酸、环丙沙星、复方新诺明不敏
感。
表4 L一59231的药敏试验结果
Tab．4 Th e drug sensitive test of L -59231
2．5 L一59231菌株16S rDNA基因序列的PCR扩
增与测序
采用通用引物扩增L一59231菌株16S rRNA，
获得大小为1 114 bp的清晰条带，PCR产物的
DNA序列见表5，经与GenBank中数据作BLAST
比对，与创伤弧菌的同源性最接近，达99％。
3 讨论
将L一59231菌株经注射和灌喂两种途径人工
感染试验鱼，结果均出现与自然发病鱼相同的症
状，且从人工感染的发病鱼体内分离到与自然发病
鱼相同的细菌，证实L一59231菌株可导致大菱鲆
患出血性败血症。出血性败血症是海水鱼类一种常
见病和多发病，研究表明，该病不具有病原特异
性_9 J。大菱鲆细菌感染后出现的不同程度皮下出
血及主要器官出血是细菌性败血症的主要表现形
式。由于发病早期出血不严重，鱼体临床症状不明
显，很难引起重视。当病鱼全身出血严重并伴随腹
水时开始出现死亡，病原菌可随排泄物在养殖环境
中播散，使感染面扩大，此时采用常规手段难以控
一
+ 一 + + 一 一 一 + +
338 大连水产学院学报 第23卷
表5 L-59231菌株16S rDNA测序结果
Tab．5 The sequencing result of 16S rDNA in strain L-59231
基因排列gene arangement 序号No
ATrGAACGCTGGCCGCAGGCCTAACACATGCAACTCGAGCCGTAACA，ITI’rNNAAAGC ITG
C，rI NGAAGATGACGAGCGGCGGACGGGTGACTAATGCCTGGGAATATGCCTrGATGTGG
GCGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATCCCTACGGGCCAAAGAGGCGGA
TCTTCGGACCTCTCGCGTCAAGA兀'AGCCCAGGTGGGATrAGC IIAG，ITrGGTGAGGTAATG
GCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGA rCAGCCACACTGGAACTGA
GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATI℃CACAATGGGCGCAAGC
CTGAAAAGTGC，ITITAC从CCCGAAGGCCTTCTrCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGC
TTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGACTC I’GGACCGTGTCTC
AG ITrCCAGTGTGGC IIGATCATCCTCTCACACCAGCTAGGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCC
TrACCTCACCAACTAGCTAATCCCACCTGGGCATATCCTGACGCGAGAGGCCCGAACCTC
CCCCTCTI1|GGCCCGTAGGCATCATGCGCTATrAGCCATCGTI I℃CAATGGTTATCCCCC
ACATCACGGCAA1’ITCCCAGGCATrACTCACCCGTCCGCCGCTCGCCACCCGAGAAACAA
CGC rCGACTTGCATGTG，IrrAGGCC I'GCCGCCAGCG I℃AATCTGA
GCCATG rCAAACTCTTCAArn’GCAGCCA，I．GCCGCGTGTGTGAAGAAGGCC ITCGGGTT
GTA从GCACrIrITCAGTCGTGACGAAGGTAGTTCCGTrAATAGCGTAATrATrrGACCTrA
GCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCCTGCCAGCCCCCGCCGTAATTCGTCGTGACTGC
GAAAACCCCTTGCATGCGCTrrACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTCCCTA
TrACCGCGGCTGCTGGCACGGAG订AGCCGGTGCTTC 兀℃TGTIIGCTAACCTCAAA rGAT
GCCGCTATrAACGACACCACCTI℃CTCACAACTG
制病情。注射感染高浓度组(4×10 cfu／mL)鱼
于试验第9天开始出现出血症状，发病个体症状迅
速加重，至第l9天试验鱼全部死亡。注射感染低
浓度组(5×10 cfu／mL)鱼在试验结束时死亡率
为71．4％。从感染试验发病情况看，该菌感染有
一定的潜伏期，死亡前的表现与细菌性败血症导致
的弥漫性毛细血管内凝血(DIC)¨叫的症状相似。
灌喂感染组鱼在第l0天开始出现体表散在出血，
腹水不明显，停止灌喂第4天症状逐渐减轻，到第
l9天仍无死亡。根据上述结果分析，灌喂感染过
程中细菌进人肠道，首先应该在肠黏膜上黏附，造
成肠壁黏膜上皮细胞损伤，引起一系列症状? 。
由于鱼体肠道黏膜屏障有一定的阻挡作用，病原菌
的侵入量低于被直接注射鱼体内的量，故其病情要
比注射感染途径轻，并且被灌喂感染的鱼由于少量
多次地接触病原菌，体内可能产生一些特异性的免
疫物质，对侵入的细菌有一定的抵抗作用，但具体
机理有待于进一步研究。由于三种感染途径病原菌
侵入量和部位不同，发病轻重也有所不同，但以全
身出血为主要症状，严重时合并腹水。创伤浸泡感
染对试验鱼的感染率为57．1％ ，说明该菌也可以
通过皮肤伤口对大菱鲆造成损伤。本试验结果表
睨，L一5923l菌株具有较强的侵袭力和扩散能力。
对L一59231菌株进行鉴定后，确定其为创伤
弧菌。该菌可引起多种海、淡水鱼类的疾病，是公
认的人兽共患病的重要致病菌，已引起人们的重
视 引。刘秀珍等[1 在国内首次报道创伤弧菌是
海水网箱养殖石斑鱼Epinephelus细菌性病原，可
导致石斑鱼死亡率高达70％ 一80％ 。它还可引起
日本鳗鲡Anguilla japonica¨引、欧洲鳗鲡AnguiUa
anguilla L】刮死亡，病鱼表现为体表溃烂，鱼体两侧
有出血点，腹部和肛门红肿、出血。沈志强等¨
曾报道，创伤弧菌可引起石鲽死亡，其主要症状
为：鳍条溃烂，上下颌、鳃及吻端充血发红，腹部
膨胀，眼眶周边出血，眼球充血、白浊和外突；死
亡石碟的体征表现为肝、胰脏呈土黄色，有坏死
点，脾肿胀坏死，腹腔积水。据简纪常等¨副报道，
创伤弧菌可感染军曹鱼，表现为鱼体发黑， 口张
开，体表黏液少，挤压肛门时有淡绿色液体流出；
眼睛突出并充血，鳃发白；腹水多，严重时伴有血
水，呈淡红色；肝脏肿大，颜色淡，肝表面有大量
淤血或出血点；肾脏水肿发黑有淤血现象；肠有炎
症和积水，积水呈黄绿色。综上所述，创伤弧菌引
发的感染，不同鱼类其症状有所不同。大菱鲆的感
染症状以出血和腹水为主，未见溃疡发生。
创伤弧菌是近年来发现的一种新的致病菌，其
毒力强，人感染后病死率高。中国有漫长的海岸
线，存在着感染创伤弧菌的潜在因素，应引起警
惕。对创伤弧菌的流行病学、病原学、临床症状及
救治措施的认识至关重要。有关创伤弧菌对大菱鲆
的致病机理。引起其病理和病理生理的变化有待进
一步研究。
0∞加啪 ∞柏∞姗∞姗伽加伽舳 ∞∞鲫 ∞加啪瑚舳啪柏∞咖∞咖 蚴啁
第5期 于兰萍，等：大菱鲆出血性败血症病原菌的分离与鉴定 339
已有研究表 ，在体外培养创伤弧菌进行
药敏试验，证明该菌株对多种抗菌药物敏感，这与
本试验中对L一59231菌株药敏试验的结果相符。
参考文献：
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
雷霁霖．海水养殖新品种介绍——大菱鲆[J]．中国水产，2000
(4)：38—39．
杨先乐，陈远新．鱼用疫苗的现状及其发展趋势[J]．水产学
报，1996，20(2)：159—167．
TORANZO A B，SANLOS Y。BAROJA J 1．Immunization with bac—
terial antigens：vibrio infections[J]．Dev Biol Smnd，1997，90：93
— 105．
HEI￡ASON E，QKATAD O A，CAUGANT D A，et a1．BacillusⅡ，1．
thracis，Badllus cereus ，and Bacillus thuringiensis one species on the
basis of genetic evidence[J]．Appl Environ Microbiol，2000，66：26
— 27．
MORENO M L．Virulence factors and pathogenicity of Vibrio
vutnO~cus strains isolated from seafood[J]．J Appl MiCrobol，
1998。84(5)：747—751．
BIOSCA E J．Comparative study of biological properties and elec—
trophoretie characteristics of lipopolysaccharide from eel—virulent
and eel—A virulent Vibrio n ∞strains[J]．Appl Environ Mi·
crobiol，1997，65(2)：856—858．
徐怀恕，杨学宋，李筠，等．对虾苗期细菌病害的诊断与控制
[M]．北京：海洋出版社，1999：166—190．
东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册[M]．北京：科学出版
社。200l：l8一l18．
王斌，孙岑，刘永波，等．养殖大菱鲆出血性败血症病原菌致病
性研究及鉴定[J]．大连水产学院学报，2006，21(2)：100—
104．
[1O] 刘宿，毕敏．创伤、手术对纤溶活性的影响[J]．国外医学：麻
醉学与复苏分册，1993，14(6)：324-326．
[11] 严亚贤，华修国．大肠杆菌O157和其它产志贺毒素大肠杆菌
的毒力因子——黏附素[J]．中国预防兽医学会，2002，24(6)：
480—483．
[12] LIN KOUS D A，OLIVER J D．Pathogenisis of V／br／o vulnificus
(Mini Review)[J]．FEMs Microbiol L~aem，1999，174：207—
214．
[13] AMARO C，BOSCA E G．Vibrio vulnificus biotype2，pathogenic
for eels，is also an opportunistic pathogen for humans[J]．Appl
Environ Microbiol，1996，62(4)：1454—1457．
[14] 刘秀珍，邹晓理，莫小燕，等．海水网箱养殖石斑鱼病原菌研
究[J]．热带海洋，1994，13(1)：8l一86．
[15] MUROGA K，JO Y，NISHIBUCH1 M．Pathogenic vibrio isolated
from cultured eels：I．Charateristics and taxonomic status[J]．
Fish Pathol，1976，l1(10)：141—145．
[16] BIOSCA E G，AMARO c，ESTEVE C，et a1．Fimt record of
V／br／o vuln~Ftcus biotype 2 from diseased European eel，AnguiUa
anguilla[J]．Fish Dis，1991，14：103—109．
[17 3 沈志强，刘吉山，李峰，等．石鲽鱼创伤弧菌病的病原分离鉴
定与防治[J]．中国兽医科技，2001，31(1O)：22—23．
[18] 简纪常，吴灶和，陈刚，等．海水网箱养殖军曹鱼弧菌病病原
的分离及其特性[J]．中国兽医学报，2003，23(4)：329—330．
[19] HALOW K D，HAMERRc，FONTENELLE L J，eta1．Primary
skin infections secondary to V／br／o m n扭 ：the role of operative
intervention[J]．J Am Coil Surg，1996，183(4)：329—334．