ICAM1在实验性自身免疫性脑脊髓炎发病机制中的作用

首席医学网      2009年05月09日 22:18:13 Saturday  108

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作者：赵亚朴 王红 刘慧敏 王秀卿 黄庆军    作者单位：050081 石家庄 白求恩军医学院(赵亚朴，王红，刘慧敏，王秀卿)； 515063 汕头 汕头大学精神卫生中心(黄庆军)

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【摘要】  目的 检测实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠血脑屏障中血管内皮细胞细胞间粘附分子1(ICAM1)的表达，并分析其表达与EAE发病的关系。方法 取EAE组和对照组大鼠的脑组织，石蜡切片，免疫组化染色，图像扫描系统观测，图像分析软件进行灰度分析。结果 EAE组大鼠脑血管内皮细胞上ICAM1的表达明显深于对照组。实验组的灰度值为141.47±6.88，而对照组为166.24±7.24，两组差异非常显著(P<0.01)。结论 大鼠EAE时脑血管内皮细胞ICAM1的表达上调，提示ICAM1是与EAE发生相关的重要粘附分子。

【关键词】  免疫组织化学法； ICAM1； 血脑屏障； 实验性自身免疫性脑脊髓炎

The investigation to the effect of ICAM1 in the nosogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis  ZHAO Yapu*，WANG Hong，LIU Huimin，et al.*Bethune Military Medical College,Shijiazhuang  050081,China

    【Abstract】  Objective  To investigate the relationship between the expression of ICAM1 in the bloodbrain barrier and the experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE). Methods  Brain of EAE as well as control animals were taken and embedded in paraffin.And the sections were stained by immunohistochemical method. Then the sections were observed by Nikon image scanning system and measured the gray value by IPP image analysis software. Results  The expression of ICAM1 in the epithelial cell of endangium of EAE rat's brain was higher than that in control. Conclusion  The increase of the expression of ICAM1 in the epithelial cell of endangium of EAE rat's brain indicated that ICAM1 was a necessary adhesion molecule in the developmental process of EAE.

    【Key words】  Immunohistochemical method；Intercellular adhesion molecular1；Bloodbrain barrier；Experimental autoimmune encephalomyelitis

    多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)可能是一种与遗传、病毒感染、地理环境等诸多因素有关的自身免疫性疾病［1］。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)与MS在临床、生化、免疫及病理等诸多方面具有相同的特征，因此成为深入研究MS的理想动物模型。在免疫学的研究中，粘附分子在EAE发病中的作用越来越受到关注。那么，血管内皮细胞细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecular1，ICAM1)在血脑屏障中的表达是否与EAE的发生有关？本研究采用免疫组化法检测了ICAM1在血脑屏障中的表达，以探讨其与EAE发病的关系。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物及分组  雌性Wistar大鼠50只，8～10周龄，体重(192±10)g，随机分为实验组(免疫抗原组)和对照组(完全弗氏佐剂/百日咳杆菌组)。实验组注射牛髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)+完全弗氏佐剂(Freund’s adjuvant complete，CFA)+百日咳杆菌；对照组注射生理盐水+CFA+百日咳杆菌，每组各25只。

    1.1.2  试剂  ICAM1羊抗鼠IgG多抗(Santa Cruz)、SP通用型试剂盒(ZYMED)。

    1.2  方法

    1.2.1  制备动物模型  MBP提取方法与动物模型制备方法沿用我们以往建立的方法［2］。EAE的严重程度依据Kono等［3］的标准评定。

    1.2.2  免疫组化法检测血脑屏障ICAM1的表达  取发病高峰期的EAE大鼠和对照组大鼠各7只，剥取大鼠的小脑，福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，每隔5张取2张，每份标本选出6张切片。使用ZYMED公司SP试剂盒，采用三步法进行免疫组化染色。用Nikon图像扫描系统进行观测。采用美国IPP图像分析软件进行灰度分析。每只大鼠取12张片子，沿矩形路线观测。

    1.2.3  统计学方法  数据资料用SPSS 11.0统计软件包进行处理，采用两组间均数比较的独立样本t检验(双侧)进行统计学分析。

    2  结果

    2.1  发病情况与体重变化  实验组25只大鼠全部发病，起病时间为(10.74±1.19)d，评分在1分以上者达100%，评分在4分以上者达45%，病死率12%。依照Kono等的评分标准，平均得分为(3.54±0.75)分。从注射抗原后0天到第15天，平均体重减轻(28.6±16.6)g；而对照组25只大鼠无一发病，体重随鼠龄的增大而持续增长，至注射后第15天，平均体重增长(14.2±5.1)g。

    2.2  脑、脊髓组织的病理改变  取发病高峰期EAE大鼠和对照组大鼠的脑和脊髓，石蜡切片，常规HE染色，光镜下可见EAE大鼠的脑和脊髓组织中有大量炎性细胞浸润(主要是淋巴细胞和单核细胞)，炎性细胞主要聚集在血管周围，形成典型的“袖套”样改变［46］，而对照组大鼠脑和脊髓组织未见炎性细胞浸润和神经细胞的变性、坏死。

    2.3  免疫组化法检测血脑屏障血管内皮细胞ICAM1的表达  镜下观察发现EAE组大鼠脑血管内皮细胞上ICAM1的染色明显深于对照组，血管内皮细胞阳性反应呈明显的棕黄色。尤其在脉络丛的血管内皮细胞处阳性反应更为明显。运用计算机图像分析系统进行分析，测量ICAM1的灰度值(灰度值是反映透光密度的定量指标，它与ICAM1表达的量呈负相关，即灰度值越高，表示ICAM1蛋白表达量越少；而灰度值越低，则表示蛋白表达量越多)［7］。从统计结果可见实验组的灰度值为141.47±6.88，而对照组为166.24±7.24，两组比较，差异有非常显著的统计学意义(P<0.01)。

    3  讨论

    EAE的病理特征之一是在脑白质部位小血管周围产生以T细胞为主的炎细胞浸润、水肿、脱髓鞘等病理改变。而血脑屏障是一种存在于血液循环与脑组织之间的屏障结构，主要由毛细血管内皮细胞组成。正常情况下，蛋白质一类大分子物质不能通过血脑屏障，甚至一些极性小分子也只能缓慢地进入脑内［8］。因此，在健康动物CNS内很难检测出T细胞及单核巨噬细胞。在本实验中，发病动物的CNS中可见到大量T细胞，说明T细胞通过某种机制穿越了血脑屏障而进入CNS造成炎症损伤。

    炎症过程一般为白细胞穿越血管内皮细胞，向炎症部位迁移。血管内皮细胞上粘附分子的表达是白细胞与血管内皮细胞粘附过程的一个重要分子基础。在此粘附过程中，首先是选择素分子介导的淋巴细胞与血管内皮细胞的不稳定粘附，随后血管内皮细胞膜结合的细胞因子作用于淋巴细胞，并激活其表面的整合素分子，导致加强粘附及穿越血管内皮细胞的过程。粘附分子ICAM1广泛分布在体内的造血和非造血细胞上。ICAM1在血管内皮细胞上也有一定数量的表达，它参与白细胞穿越毛细血管壁到达炎症部位的过程。ICAM1在血管内皮细胞上的表达受一些因素的影响，如：炎症介质能明显上调内皮细胞和其他非造血细胞ICAM1的表达［9,10］。据Steffen等［11］报道，在正常CNS的微血管内皮细胞中可检测到少量表达的ICAM1，正常脑室脉络丛上皮细胞可表达ICAM1。即正常情况下，ICAM1可以在血管内皮细胞有低水平的表达。

    本组实验发现，无论是对照组大鼠还是实验组大鼠，其脑组织血管内皮细胞中均可观测到ICAM1。不同的是EAE大鼠ICAM1的表达显著高于对照组, 提示ICAM1是与EAE发生相关的重要的粘附分子，同时，ICAM1的表达在炎性细胞因子如TNFα、IFNγ等刺激下明显增高。而本研究小组在系列研究中发现，TNFα、IFNγ在EAE模型增高，与本组研究结果相一致。提示TNFα和IFNγ在EAE发生中的致病作用可能是通过增加ICAM1在脑组织血管内皮细胞的表达, 进而介导T细胞和其他炎性细胞穿越血脑屏障来实现的。

    对ICAM1的检测表明，EAE中粘附分子表达的上调与EAE的发生密切相关。可以设想，通过封闭粘附分子，减少或阻止白细胞介导的组织损伤有可能成为未来预防或治疗EAE极有前途的方式之一。

【参考文献】
  1 Braunwald F, Kasper H, Longo J,et al.哈里森内科学.人民卫生出版社,2003.30263030.

2 赵亚朴,黄庆军,魏林,等.牛脊髓髓鞘碱性蛋白的提取及初步鉴定.中风与神经疾病杂志,2006，23(3)：315317.

3 Kono DH,Urban JL,Horvath SJ,et al.Two minor determinants of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice.J Exp Med.1998,168(1):213227.

4 董梅,刘瑞春,郭力,等.Wistar大鼠多病程实验性变态反应性脑脊髓炎的模型建立.中国免疫学杂志，2006，22(1):7881.

5 刘学彬,冯璞,谢蜀生. 髓鞘碱性蛋白的提取鉴定及其诱导的口服耐受.北京医科大学学报,1998，30(4)：320322.

6 余昌胤,郑和忠,范瑞明.大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎CD4+,CD8+的改变及意义.中国临床康复,2006,10(34):7677.

7 沈强,刘亚敏,张赐安. 麝香、冰片对全脑缺血再灌注大鼠脑微血管内皮细胞ICAM1表达的影响. 中西医结合心脑血管病杂志,2003,1(3):136138.

8 Briscoe DM, Cotran RS, Pober JS. Effects of tumor necrosis factor, lipopolysaccharide, and IL4 on the expression of vascular cell adhesion molecule1 in vivo. Correlation with CD3+ T cell infiltration.J Immunol,1992,149(9):29542960.

9 陈慰峰.医学免疫学.北京：人民卫生出版社,2005.102115.

10 Lee SJ，Benveniste EN. Adhesion molecule expression and regulation on cells of the central nervous system. J Neuroimmunol,1999,98(2):7788.

11 Steffen BJ，Breier G，Butcher EC，et al.ICAM1，VCAM1，MAdCAM1 are expressed on choroid plexus epithelium butnot endothelium and mediate binding of lymphocytes in Vitro. Am J Pathol，1996,148(6)：18191838.