紫外成像高灵敏检测器

摘要：单分子检测开辟了生命科学研究的新方向。许多生物反应和分析可以用以前无法进行的微量样品检测，而单个分子的行为和相互作用即使在其天然的细胞环境中也能够被跟踪。然而，应用范围的这一扩展对检测技术提出了更高的要求，特别是新型检测器必须的两个核心要求：高灵敏度和快速。 A Sensitive Detector for Ultralow-Light Imaging
Colin G. Coates
Abstract: Trends toward single-molecule measurements are opening up new vistas in life science research. Many biological reactions and assays can now be carried out with minute samples, which formerly were insufficient for measurement purposes, and the behavior and interactions of individual biomolecules can be tracked even within their natural cellular environments. However, extending the scope of this work is placing heavy demands on detection technology; specifically, new detectors are needed with two key requirements:
sensitivity and speed.
目前，对单分子检测的研究将低浓度分析引入了一个新时代。生物反应与检测在样品量很小时也能进行，这样的样品量在常规检测中是不能满足需要的，而单个分子的行为和相互作用即使在其天然的细胞环境中也能够被跟踪。此外，诸如细胞内的离子信号显微镜（例如Ca2+ 通量显微镜）和多维（4-5D）显微镜技术对检测技术提出了相当高的要求，这些要求可以从本质上归结为两个核心：高灵敏度和快速。
所采用的光电组件必须足够灵敏，这是因为：1）低染料浓度和单分子弱信号的检测；2）解决曝光时间短造成的光通量较低的问题(补充快速的画面速度)；3）检测由于激发能量降低造成的较弱光通量（降低染料褪色和对组织的光损伤并延长时间寿命）；4）克服高速输出时的严重噪音对检测限的影响。例如，高画面速度能够促进：1）单个生物分子之间动态相互作用的研究；2）单分子跟踪；3）对单分子瞬闪影响的研究；4）与细胞内离子信号传导研究的大量瞬时分辨要求相一致的快速钙通量过程的记录；5）共焦3- 或4-D 累加的快速Z- 阵列构建。
1 灵敏度
在讨论如何提高灵敏度之前，先对电荷耦合装置（CCDs）[1]和其他检测器灵敏度的性质有所了解是非常重要的。有两个参数显著影响检测灵敏度：量子效率(QE)和系统噪音。量子效率用来衡量光电组件捕获有价值光子的能力，高量子效率意味着在CCD 像素内有更多的光子被转化成光电子。一旦转化完成，在一定像素内的光电子必须超出检测限或光电组件的噪音基线，而这是由系统噪音决定的。增大量子效率和减小噪音将使很弱的信号也能够被检测。
在进行总体的信噪比数值比较时，必须了解单个噪音的影响以确定信号是否能够被检测。最重要的是，信号必须扣除基线噪音。如图1所示，主要的噪音源由弱信号的二维- 线形强度曲线（仅占用有限数量的像素）可以说明。
系统噪音由两部分组成：暗电流噪音和输出噪音。当在背光电子增幅电荷耦合器件（BVEMCCD）（Andor Technology Ltd., Belfast, Ireland）中采用增强的热电冷却后，暗电流基本上被消除（注意，BV是指优化的可见/近红外范围）。这样，光电组件的输出噪音就是真正的检测限，尤其是在快速成像时。输出速度越快（多通道-MHz） 输出噪音越大，例如，在输出速度为5MHz 时，输出噪音大于40 个电子的均方差，输出速度小于1MHz 时这一数值降低到2 个电子的均方差。
短噪音决定信号的定量偏差，反映了测量信号对真实值的波动程度。检测器的短噪音与光强度和检测器量子效率相关。量子效率较高的背光传感器可以获得更高的信号- 短噪音比。原因很简单，短噪音是真实信号的平方根，必须由传感器上的真实光电子数目计算得到，而不是简单由输入的光子数决定。这样，除了信号- 短噪音比较高外，量子效率高的检测器还能够获得相对噪音基线更强的响应信号。
2 光电倍增
光电倍增CCD 技术是基于专利L3 VisionTM 的传感器技术（E2V，Chemlmsford, U.K.）,[2-4]这一技术有时被认为是芯片上的倍增技术。它提供无须影象增强就能够检测单个光子的影象传感器。安装在芯片上的电子增幅部件，避免了放大管的严格量子效率和分辨率限制。[5,6] 这一结构称为增益处理器，包含位于输出放大器之前的一系列象素（见图2），通过它形成从CCD 传感器的每个象素输出信号的通道。每经过这样一个象素，都可以获得一个较单独电荷转移所需更高的电压，导致碰撞离子化的现象发生。这使得在每一步产生额外电子成为可能（ 可能性取决于所施加的可调电压）。在处理后，得到相当高的放大因子（几千倍在技术上是可能的）这样，增幅可以增大到一定程度, 并可轻易地通过软件进行实时调节，非常弱的信号也有可能以任何输出速度获得高于光电组件的输出噪音的检测信号。这一点非常重要，因为灵敏度和速度互相矛盾，如何结合两者是标准CCD 中的传统问题，
例如，较大的输出噪音制约了象素输出速度。采用这一技术的iXon 镜头- 传输光电组件（Andor chnology），实现了快速的画面传输能力与单个光子检测灵敏度的结合。[5-7]
3 提高灵敏度的整合技术
如前所述，EMCCD 技术消除了基线噪音并实现了单光子检测灵敏度。前照明( F I - EMCCD)非常适合超低光的应用。然而，背光传感器在可见和近红外范围提供最大的量子效率（峰值>90%）；[7]这样，大多数入射光子在传感器上被捕获并由电子倍增技术放大。信号强度增加，改善了信噪比，以前无法检测的信号也能够得到检测。如果信号非常弱，FIE MC CD 在发射区域也只能检测到几个光子，BV-EMCCD 技术还能够区分信号是否被“看到”。在这种情况下，用BV-EMCCD 转换和检测增加的光子（例如，增加2 倍）能够确认是否有信号存在。
4 实验研究
以遮光成像池和弱针孔光源为例来阐明EMC CD 技术。一个带有聚焦镜头的F I - EMCCD512 × 512iXon 光电组件安装在实验室搭建的成像室的顶部，一个红色发光二极管（λ max~620nm）安装在半透明的样品平台下面。在平台上有一个刻有针孔阵列的黑色卡片，插入强中性滤光片， 这样在很短的曝光时间内（十毫秒），当EM 增益关闭时，从点光源发出的光子流太弱，导致信号完全被输出噪音基线掩盖。
增益的效果如图3 所示。为了更直观的观察信噪比，还给出了通过底部针孔点的线形强度图。在零增益时，这一点发出的信号完全被光电组件的输出噪音掩盖。然而，当施加5×，10× 增益时， 信号增强达到检测限。进一步增大增益，输出噪音成为次要因素，需要考虑的是信号- 短噪音比。既然这些图象在本质和信号级别上都与优化的单分子（SMD）设备（例如，使用全内反射荧光显微镜[TIRFM]）[8-11]的预期结果相似，这一实验说明可以使用EMCCD 对单分子进行检测。然而，这一图象代表的是经过良好优化的单分子检测，因为在这里显示的范围内单光子背景在TIRFM 实验中是不可能被排除的。
图4 显示的是由FI-EMCCD 512 × 512iXon 光电组件记录的一个真实的单光子的图象。拍摄条件为在玻璃表面上的17 帧/ 秒的单Cy-3 荧光，使用TIRFM。以3- 维强度平面图举例说明了与基线噪音相关的单个分子强度。
将FI- 和BV-EMCCD 光电组件进行了极弱低光实验评价以说明其对基本S/N 的效果。[7]相机被整合到Nipkow 旋转盘（Yokogawa Electric, Yamanashiken, Japan），共焦显微镜上采用常用Ca2+ 结合剂Fluo-4 染料（Molec ular Pro bes, Eugene, OR）对平滑肌细胞内离子（Ca2+ 通道）进行快速常规测量。将咖啡因注射入细胞诱导细胞内钙离子的快速释放并记录影象的动力学级数。
本实验中采用的两种EMC CD 光电组件型号都具有128 × 128 像素以便能够达到>100 帧/ 秒，适应Ca2+ 通道成像的动力学测定要求。截止到本文发稿，这种相机已经可以达到>400 帧/ 秒。这种旋转磁盘方法是低- 光显微镜的一个优秀范例，它能够提供2-20 光子/ 像素/帧范围内的光通量，适用于超灵敏检测技术。此外，此技术的共聚集性质减小了背景光子，保证了光电组件的有效使用（例如，一旦EM 技术应用于消除输出噪音基线，背景光子检测限不再是限制因素）。此外，488nm 的Ar+ 离子激发激光的能量可以设为最小（备用设置）。
当光通量非常小的时候，每个光电组件检测大量细胞。用BV-EMCCD 记录的信号较FI-EMCCD 强。[7] 实际上，在Fluo-4 的最大发射波长516nm，使用背光比前照明信号增强4.6 倍，信号- 短噪音比增加2.15 倍。图5 是采用这两种光电组件记录的影象，获得同一细胞的信号极弱的动力学级数数据。FI 光电组件首先记录，然后是BV 光电组件，这是为了确保任何信号强度的区别都是由光电组件造成的而不是由于细胞的降解或者染料的光漂白。在加入咖啡因前后（图5a），根据光电组件的图象， BV 光电组件的信号强度较强。在选出的图象中，由同一个细胞的横截面得到的线性强度对照图如图5b 所示。清楚的显示了BV-EMCCD 在信号- 短噪音比方面的改进。图5c 显示了通过制造商提供的影象软件对每个细胞的动力学曲线进行ROI 定量分析，每条曲线都显示Fluo-4 发射强度随着咖啡因的加入而增大。很明显，尽管采用了ROI 像素均衡，在加入咖啡因前，FI 光电组件的低量子效率引起的高短噪音基线会导致更大的噪音。图5d 显示的是每个影象的3D 平面图。在加入咖啡因到细胞之前，最低质量的信号是由FI 相机记录的，BV 光电组件的信噪比较好。
5 结论
EMCCD 技术（芯片倍增）显示了高效成像的潜力，许多CCD 技术的未来发展很可能会集中于这一领域。背光EMCCD 相机将超高光子聚集效率和消除输出噪音检测限的能力结合起来。进一步的发展需要将EMCCD 技术和基于显微镜头的隔行CCDs、多通道输出端口和不断增长的快速输出速度结合起来。