骨髓间充质干细胞输注对再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血功能的影响1

骨髓间充质干细胞输注对再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血功能的影响
来源：中国论文下载中心    [ 08-03-01 16:51:00 ]    作者：黄永兰，黄绍良，蔡耘    编辑：studa20
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【摘要】  本研究探讨人源骨髓间充质干细胞（MSC）输注对免疫介导性再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血功能及生存率的影响.采用雌性BALB/c小鼠30只，参照姚军等方法建立免疫介导性再生障碍性贫血模型，实验分模型组、MSC组及照射组。MSC组于制模后3天从小鼠尾静脉1次性输注人骨髓MSC 1×106，观察各组小鼠外周血象变化、第28天存活率、骨髓有核细胞数量、造血集落生成和骨髓病理学特征。结果显示：于制模后第7天，模型组外周血WBC显著低于MSC组和照射组，分别为（0.65±0.05）×109/L，（2.45±0.71）×109/L，（2.30±0.33）×109/L；第10天3组均表现为全血细胞减少，第14天模型组血象指标仍持续降低，而MSC组及照射组血象指标开始回升，至28天3组小鼠存活率分别为18.2%、80%和100%，MSC组小鼠存活率显著高于模型组（p<0.01）。MSC组小鼠单侧股骨有核细胞数量、造血祖细胞集落生成数量均显著高于模型组，而与照射组结果一致。结论：MSC输注可减轻再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血衰竭程度，提高存活率。
【关键词】  再生障碍性贫血
Effect of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Infusion on Hemato poiesis in   Mice with Aplastic Anemia
Abstract    To explore the effects of infusion with  humanmesenchymal stem cells from bone marrow  on bone marrow hematopoieticfunction and survival in mice with aplastic anemia (AA), immunomediated aplastic anemia  mice model was established accordingto Yao′s method. Thirty BALB/c female mice were divided into AA modelgroup, MSC group and radiation  group. In MSC group, 1×106  MSC wasinfused by intravenous injection at 3 days after  establishment ofmodel.The changes ofblood count， the number of nuclear cells in a single thighbone,colonyforming units(CFU), pathological features of bone marrow  andsurvival rate of mice were observed in all groups. The results showedthat the number of white blood cells in peripheral blood of AA modelgroup at day  7 after establishment of  model was （0.65±0.05）×109/L ,whichwas significantly lower than those in MSC group and radiation alonegroup, respectively. Pancytopenia was found in all three groups at  day10. At day 14  the pancytopenia was continued in AA model group while it was less severe in MSC and radiation groups. In MSC group the numberof nucleated  cells in single thigh bone and pathological slice as wellas CFUGM were significantly higher than those in AA model group,respectively. The survival rate of mice in MSC group was 80.0% whichwas higher than that of group in AA model (18.2%, p<0.01).There wereno significant differences between MSC group and radiation alone groupin bone marrow hematopoiesis and survival rate. It is concluded thatMSC infusion  reduces the degree of bone marrow failure and improvesurvival of immunomediated AA mice model.
Key words    aplastic anemia； animal model； mesenchymal stem cell； hematopoiesis
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）除具有促进造血干细胞移植后造血重建外，还具有免疫调节作用，防治移植物抗宿主病［1，2］。获得性再生障碍性贫血主要是T淋巴细胞介导的骨髓造血功能衰竭［3，4］，且再生障碍性贫血患儿骨髓MSC体外增殖能力较正常对照儿童明显减弱［5］。本研究探讨人源骨髓MSC对免疫介导性再生障碍性贫血小鼠骨髓造血功能及生存率的影响，再生障碍性贫血模型的建立
清洁级雌性BALB/c小鼠（H2d、Mlsb），8-10周龄，16-18 g，作为受者。清洁级DBA/2小鼠（H2d、Mlsa），6-10周龄，为淋巴细胞供者。两者均由中山大学动物实验中心提供。参照文献［6］建立免疫介导性再生障碍性贫血模型。取DBA/2小鼠颈椎脱臼处死，常规消毒，无菌取出胸腺及颈部、颌下、腋窝、腹股沟、肠系膜等处淋巴结，分别获胸腺、淋巴结细胞悬液,细胞浓度为5×106/ml，按胸腺细胞与淋巴结细胞以1∶2比例混合，即胸腺淋巴结细胞悬液。台盼蓝鉴定细胞活性，活性细胞>95%。雌性BALB/c小鼠经5 Gy  60Co γ射线全身照射（剂量率125.35cGy/min），照射后20小时内由尾静脉注入DBA/2小鼠胸腺淋巴结细胞1×106/只。小鼠照射后立即移入中山大学动物实验中心SPF级无菌层流室内，饮用加有庆大霉素（40万U/L）和二性霉素B（50mg/L）高压灭菌水，每日观察并记录小鼠体重、活动力、外表、饮食、大便、死亡情况，制模后28天实验终止。
MSC分离、扩增及输注
取正常儿童骨髓2 ml，按本室已建立的方法［7］进行MSC分离、扩增，传代至4-5代时收获细胞，于制模后第3天（照射后72小时）经小鼠尾静脉注射人源MSC 1×106。
实验分组
雌性BALB/c小鼠30只，分为3组：①再生障碍性贫血模型组：11只，照射+胸腺淋巴结细胞输注；②MSC组：10只，照射+胸腺淋巴结细胞输注+MSC输注；③单纯照射组： 9只，仅照射。
观察指标
生存率及生存曲线。  比较各组小鼠生存情况。
外周血象检测  于制模后第7、10、14、21天分别断尾，微量吸管采集肝素抗凝血20 μl，细胞计数仪检测白细胞（WBC）、血红蛋白（Hb）、血小板（Plt）水平。
单侧股骨有核细胞数测定及骨髓造血祖细胞集落培养 于制模后28天或濒死时颈椎脱臼处死实验小鼠，在无菌条件下取出右侧股骨，用不含血清IMDM培养液冲洗细胞，离心，弃上清，加1 ml IMDM混匀，计单测股骨有核细胞数量。取2×104 细胞接种于1    ml甲基纤维素半固体培养基MethocultTMGFM3434（美国Stem Cell公司产品）中进行造血祖细胞集落培养，于第7天在倒置显微镜下计数粒巨噬细胞集落（CFUGM）。
组织学检查  于制模后28天或濒死时颈椎脱臼处死实验小鼠，取小鼠肝、脾及左侧股骨，富尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色,显微镜下观察组织学变化。
统计学处理
用SPSS 11.5 软件处理资料，多组均数的比较采用OnewayANOVA, 绘制KaplanMeier生成函数曲线并对其进行Log Rank检验。