多位学者推荐：超级简单的分离新方法

生物通报道：来自霍德华休斯医学院，西雅图弗莱德哈金森癌症研究中心的研究人员提出了一种可以用于分离特异组织细胞的简单方法，这有利于更加方便的进行不同组织类型的基因表达和染色体修饰分析。这一研究成果公布在Cell出版社旗下的《DevelopmentalCell》杂志上，并获得了F1000多位专家的联合推荐。

领导这一研究的是弗莱德哈金森癌症研究中心的StevenHenikoff教授，这位科学家在研究技术方面获得了多项突破，曾发明了TILLING技术，这一全新的反向遗传学技术已经应用于多种生物中，如拟南芥、玉米、水稻、百脉根、小鼠、斑马鱼、果蝇、线虫等，可以通过高通量检测方法，快速有效的从化学诱变剂EMS诱变过的突变群体中鉴定处点突变，TILLING技术开创了一种高通量，低成本反向遗传的新局面，对于未来的医学检测，生物制药等方面具有重要的意义。

而在这篇题为“A Simple Method for Gene Expression and Chromatin Profiling ofIndividual Cell Types within aTissue”的最新文章中，Henikoff教授提出了另外一种新方法，可以分离特异组织细胞的简单方法。

研究分析发育过程中的特殊细胞的功能和生长情况，需要分离不同细胞类型的细胞，目前常用的组织细胞分检方法需要许多复杂的设备，比如显微镜和流式细胞仪等，而且过程繁琐，对于研究人员来说是一件费时费力的工作。

Henikoff教授发现了一种能在体内标记并分离特殊细胞类型细胞核的简单方法，这种方法利用一种融合了生物素配基识别多肽的核被膜靶向序列，通过在目标细胞中表达，从而达到识别的目的，这能让研究人员更加方便的进行不同组织类型的基因表达和染色体修饰分析。

据称利用这种方法分拣细胞只需要用磁珠，比如说选定一种可以转化的模式生物，然后设计一个核膜蛋白的质粒（由组织特异性启动子、显色蛋白（如GFP）、亲和性结构（如biotin）、核膜蛋白组成），质粒转化后分离细胞，提取组织总细胞核，然后用识别biotin的磁珠吸引分离那些特异表达核膜蛋白的细胞核，这样就能进行不同类型的细胞的基因表达，染色体方面的研究了。

这篇文章就是以拟南芥为例，利用这种方法进行了分离，从中发现了上百个特殊类型细胞中倾向表达的基因，继而了解了毛细胞与非毛细胞的基因表达差异。

（生物通：万纹）

附：

TILLING技术

TILLING 技术的基本原理是：通过化学诱变方法产生一系列的点突变，经过 PCR扩增放大，经过变性复性过程产生异源双链 DNA分子，再利用特异性识别异源双链中错配碱基的核酸酶切开错配处的 DNA，然后进行双色电泳分析。

TILLING 技术的特点与优势

A 、技术相对简单

由于 TILLING技术是传统的化学诱变技术与双色红外荧光检测技术的有机相结合，不需要复杂的技术和设备就可以对突变体库进行大规模筛选，是一种高通量并且相对廉价的技术，提高了筛选效率。

B 、可以预测突变频率，获得满意的突变密度使用群体较小

TILLING技术可以预先估计突变的概率，指导突变体库的构建。化学诱变技术的突变频率可以预先估算出来，如 EMS主要诱导碱基从 C到T的改变，有实验证实，发生 C/G到 T/A的转变有 99%的概率（4）。对这一频率的计算对于确定目标基因的最佳扩增片段有重要的指导意义。于不同物种、不同受体的诱变频率有很大差异（5），对突变频率的合理估算将增加 TILLING的效率。据现有的拟南芥 ATP项目的粗略计算，每 1Mb约含有 4个突变，即每250kb左右含有 1个突变，以这一突变密度估算，获得满意的突变密度所需的突变体群体大小小于 10000个植株（ 6）。

C 、高通量、自动化操作可以快速获得鉴定结果

TILLING技术集成了自动加样设备、高通量的电泳检测设备，以及优秀的图象处理和分析系统，容易的实现了自动化操作。目前拟南芥中TILLING技术己能够完全自动化（ 7）。对于有着高突变频率的群体 (如 ATP项目中，每个基因组中含有约 1000个突变，即突变频率约为每1Mb含有 7个突变 )，一天就可以筛选出 20个突变，至少可以获得一个被敲除的基因突变和超过12个以上的一系列错义突变。如果用标准的自动加样器结合自动化手臂的操作替代手工操作，有望把筛选量增加到每天 16轮，这样每天就可以鉴定 3到4个基因。由此可见， TILLING技术适应了大规模高通量的筛选要求。

TILLING 技术的应用

A 、在功能基因组中的应用

TILLING 首先在拟南芥中得到实际应用，2001年，以美国为首的北美实验室启动了拟南芥的 TILLING项目 (Arabidopsis TILLING Project，简称ATP)，该项目在立项的第一年就为拟南芥研究者们提供了超过 100个基因的 1000多个突变位点。 ATP项目的成功运作为TILLING技术提供了成功的应用范例，从而有力推动了该技术在其他物种中广泛应用。目前在植物中已建立包括拟南芥、白脉根、玉米（ 8）的TILLING技术平台。

B 、在作物品种改良中的应用

转基因作物 (Genetic ModifiedOrganism)正受到广泛的争论，而且转基因作物无一例外不是通过费时费力的载体构建和遗传转化步骤。分子标记辅助选择 (molecularmarker assistant selection)在现代育种中也体现了良好的应用前景，但是不能对目标基因进行定向改造，缺乏预见性。TILLING技术 一经报道便很快被广泛应用于农业上进行基因型和表型的相关性研究，并且 有望克服上述问题。

C 、在生物进化和检测多态性中的应用

生物体物种间 DNA存在广泛的多态性，对于生物进化等具有主要意义。目前，用于发现 DNA多态性的常用方法有：测序、单链构象异构多态性(SSCP)、杂交和微阵列等，但是，这三种方法各有利弊，测序的花费较高，时间也较长;SSCP的通量虽然较高，但对于新发突变，其检出率较低，杂交和微阵列不但花费高，而且检出率不足 50%（ 9）。在TILLING技术基础上发展起来的 EcoTILLING (ecotypicTILLING)技术不需要进行让学诱变，可直接用干检测生物的基因多态性（ 10）。在检测自然突变的过程中，不但可以检测到单核苷酸多态性(SNP)，还可以检测小片断的插入、缺失和微卫星序列。

与以上三种方法相比， EcoTILLING技术具有通量高、成本低、定位准确等优点。 Comai等利用 EcoTILLING技术对拟南芥自然群体中不同生态型的 5个基因进行多态性检测，发现了包括单核营酸多态性等一系列复杂的多态性（ 11）。

原文摘要：

A Simple Method for Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types within a Tissue

Hint: Rollover Authors and Affiliations Basic Sciences Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA 98109, USA
Howard Hughes Medical Institute, Seattle, WA 98109, USA
Corresponding authorHighlights
An affinity-based method was developed to purify nuclei from specific cell types
High yield and purity of nuclei were obtained from each of the tested cell types
Gene expression and chromatin profiles of individual root cell types were generated
This method does not require specialized equipment and should be widely applicable
Summary
Understandingthe production and function of specialized cells during developmentrequires the isolation of individual cell types for analysis, but thisis currently a major technical challenge. Here we describe a method forcell type-specific RNA and chromatin profiling that circumvents many ofthe limitations of current methods for cell isolation. We used in vivobiotin labeling of a nuclear envelope protein in individual cell typesfollowed by affinity isolation of labeled nuclei to measure geneexpression and chromatin features of the hair and non-hair cell types ofthe Arabidopsis root epidermis. We identified hundreds of genes thatare preferentially expressed in each cell type and show that genes withthe largest expression differences between hair and non-hair cells alsoshow differences between cell types in the trimethylation of histone H3at lysines 4 and 27. This method should be applicable to any organismthat is amenable to transformation