发酵过程控制

第六章 发酵过程控制
第一节 温度控制
第二节 pH值控制
第三节 泡沫控制
第四节 补料控制
第五节 菌浓和基质对发酵的影响
第六节 二氧化碳和呼吸商
第七节 微生物发酵终点的判断
重点:温度控制;发酵热;温度对发酵的影响; pH值的控制;pH值对菌生长和代谢产物形成的影响;影响pH变化的因素;发酵过程中pH的调节及控制;泡沫的控制;发酵过程中泡沫的变化;补料的控制;菌体浓度对发酵的影响与控制;基质对发酵的影响;二氧化碳对菌体生长和发酵的影响;呼吸商与发酵的关系;发酵终点的判断.

发酵过程的主要控制参数
⑴ pH值: 显示发酵过程中各种生化反应的综合结果.
⑵ 温度:不同的菌种,不同产品,发酵不同阶段所维持的温度亦不同.
⑶ 溶氧浓度(DO值,简称溶氧):一般用绝对含量(mg/L)来表示,有时也用在相同条件下氧在培养液中饱和度的百分数(%)来表示.
⑷ 基质含量:定时测定糖(还原糖和总糖),氮(氨基氮或铵氮)等基质的浓度.
⑸ 空气流量:每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积,也叫通风比.一般控制在0.5～1.0 L/(L·min).
⑹ 压力:罐压一般维持在0.02～0.05 MPa.
⑺ 搅拌转速:控制搅拌转速以调节溶氧.以每分钟的转数表示.
⑻ 搅拌功率:常指每立方米发酵液所消耗的功率(kW/m3).
⑼ 黏度:细胞生长或细胞形态的一项标志,也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况,通常用表观黏度表示之.
⑽ 浊度:澄清培养液中低浓度非丝状菌的OD值与细胞浓度成线性关系.一般采用分光光度计的波长420～660 nm测量,要求吸光率0.3～0.5.波长600～700 nm间,一个吸光率单位大约相当于1.5 g细胞干重/L.浊度对氨基酸,核苷酸等产品的生产是极其重要的.
(11) 料液流量
(12) 产物的浓度:
(13) 氧化还原电位:限氧条件发酵用氧化还原电位参数控制则较理想.
(14) 废气中的氧含量:从废气中的氧和CO2的含量可以算出产生菌的摄氧率,呼吸商和发酵罐的供氧能力.
(15) 废气中的CO2含量:揭示产生菌的呼吸代谢规律.
(16) 菌丝形态:衡量种子质量,区分发酵阶段,控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期长短的依据之一.
(17) 菌体浓度:是控制微生物发酵的重要参数之一,特别是对抗生素次级代谢产物的发酵.常根据菌浓来决定适合的补料量和供氧量.
由以上参数计算得出的菌体生长比速,氧比消耗速率,糖比消耗速率,氮比消耗速率和产物比生成速率也是控制产生菌的代谢,决定补料和供氧工艺条件的主要依据,多用于发酵动力学的研究.
第一节 温度控制
1 发酵热
伴随发酵的进行而产生的热量叫发酵热;发酵热的产生引起发酵液温度变化.在发酵过程中,某些因素导致热的产生,另外一些因素又导致热量散失.
产热>散热 净热量堆积 发酵液的温度上升;
相反,产热小于耗热,温度下降.
下面具体分析产热和散热的因素.
1) 生物热Q生物
在发酵过程中,菌体不断利用培养基中的营养物质,将其分解氧化而产生的能量,其中一部分用于合成高能化合物(如ATP)提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量,其余一部分以热的形式散发出来,这散发出来的热就叫生物热.
微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多.
生物热与发酵类型有关
微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多
一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水
好氧:产生287.2千焦耳热量,
183千焦耳转变为高能化合物
104.2千焦以热的形式释放
厌氧:产生22.6千焦耳热量,
9.6千焦耳转变为高能化合物
13千焦以热的形式释放
二个例子中转化为高能化合物分别为63.7%和42.6%
特点:
具有时间性;
具有生物特异性;
与营养有关;
如果培养前期温度上升缓慢,说明菌体代谢缓慢,发酵不正常.如果发酵前期温度上升剧烈,有可能染菌,此外培养基营养越丰富,生物热也越大.
2) 搅拌热Q搅拌
在机械搅拌通气发酵罐中,由于机械搅拌带动发酵液作机械运动,造成液体之间,液体与搅拌器等设备之间的摩擦,产生可观的热量.搅拌热与搅拌轴功率有关,可用下式计算:
Q搅拌=P×860×4186.8(焦耳/小时)
P——搅拌轴功率
1千瓦时=860×4186.8焦耳
散热的情况:
蒸发热:空气经发酵液时,发酵液中有部分水汽化,变成水蒸气,随空气一起排出罐外,这部分水汽化时带走的热量用Q蒸发表示,假设进出口气体温度相同,则由通气带走的热量为:
Q蒸发=G(I出-I进),G:空气流量;I:气体热焓;
辐射热:通过罐体表面向环境中发射红外线而散失的热量.热量的大小决定于罐内外温度差大小,罐的表面积等.冬天大一些,夏天小一些,一般不超过发酵热的5%.
发酵过程中,发酵液温度变化取决于上面几个因素:
Q发酵 = Q生物 + Q搅拌 - Q蒸发 - Q辐射
2 发酵热的测量及计算
发酵热的测定可采用以下几种方法:
①利用热交换原理: 测量冷却水进出口的水温,再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热.
Q发酵 = G*Cm(t2 – t1)/V
Cm——水的比热 G——冷却水流量
②利用温度变化率S(℃/h):先使罐温恒定,再关闭自控装置,测量S,根据
Q发酵 = (M1*C1 + M2*C2)S
③热力学方法:
根据盖斯定律:"在恒压和横容条件下,一个反应不论是一步完成或几步完成,其反应热是相同的".这实际上是热力学第一定律的必然推论,因为焓(H)是状态函数,过程的焓变与途径无关,只决定于过程的始态和终态.发酵热可根据标准燃烧热或标准生成热来计算.
ΔH=∑(△H)反应物-∑(△H)产物
计算时,首先查出发酵所用的各种原料及产物的标准生成热或燃烧热,再根据实际发酵中,各原料的消耗及产物的生成量,利用上述公式即可求出过程的焓变.
3 温度对微生物生长的影响
任何微生物的生长温度均在一定范围内,可用最高温度,最适温度和最低生长温度进行描述;
温度影响微生物生长的机理
(1)影响酶活性.
(2)影响细胞膜的流动性.
(3)影响物质的溶解度.

在微生物培养过程中,生长速率的变化可描述为:
上式表明:实际比生长速率是生长与死亡速率平衡的综合反映.
μ,α均与温度有关,其关系可由Arrchnius公式来描述:
不同微生物的生长对温度的要求不同,根据它们对温度的要求大致可分为四类:嗜冷菌适应于0～260C生长,嗜温菌适应于15～430C生长,嗜热菌适应于37～650C生长,嗜高温菌适应于650C以上生长
葡萄糖过量的培养基上温度对大肠杆菌生长比速的影响
温度对微生物生长的影响具体表现在:
(1)有最适宜温度范围.
(2)高温使蛋白质凝固.耐热能力与pH值有关.
T
V
最低
最适
最高
微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致.液晶状态是指某些有机物在发生固相到液相转变时的过渡状态称为液晶态.
酶在低温条件下的结构完整性和催化功能
不能低温合成蛋白质,一方面是由于其核糖体对低温的不适应,翻译过程中不能形成有效的起始复合物,另一方面是由于低温下细胞膜的破坏导致氨基酸等内容物的泄露.
低温微生物可合成冷休克蛋白
微生物受高温的伤害比低温的伤害大,低于最低温度,微生物代谢受到很大抑制,并不马上死亡.这就是菌种保藏的原理.
4 温度对发酵的影响
(1)影响产物生成速度
(2)影响发酵液性质
(3)影响产物种类
a.改变体内酶系→中间产物种类→产物种类;
b.使代谢比例失调;
(4)影响产物特性

影响合成方向:用米曲霉制曲时,如温度在低限时,得到蛋白酶,此时α-淀粉酶的合成受到抑制.金色链霉菌在低于30C时合成链霉素,温度到达35C时,只产四环素
影响产物生成量:黑曲霉生长最适温度33-37C,积累柠檬酸的最适温度在32C
影响产物质量:凝结芽孢杆菌合成α-淀粉酶时,发酵温度控制在55℃时,合成的α-淀粉酶较耐高温,在90℃,60min条件下,其活性丧失仅10%左右,而发酵温度控制在35℃时,合成的α-淀粉酶在相同条件下丧失90%.
温度对菌的生长,产物合成的影响可能是不同的
120C～300C
5 温度的控制
由于微生物在生长和发酵过程中,对温度有以上要求,在生产上,为获得较高的生产率,针对所用菌种的特性,在发酵周期的各阶段需要进行温度控制,提供该阶段微生物活动的最适温度.
温度还影响基质溶解度,氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收.因此对发酵过程中的温度要严格控制.
最适温度的选择
1)根据菌种及生长阶段选择
微生物种类不同,所具有的酶系及其性质不同,所要求的温度范围也不同.
如黑曲霉生长温度为370C,
谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30～320C,
青霉菌生长温度为300C.
前期菌量少,取稍高的温度,使菌生长迅速;
中期菌量已达到合成产物的最适量,发酵需要延长中期,从而提高产量,因此温度要稍低一些,可以推迟衰老.因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成.
后期产物合成能力降低,延长发酵周期没有必要,就又提高温度,刺激产物合成到放罐.
如:
四环素生长阶段280C,合成期260C后期再升温;
黑曲霉生长370C,产糖化酶32～340C.
但也有的菌种产物形成比生长温度高——谷氨酸产生菌生长30～320C,产酸34～370C.
最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验.
例:林可霉素发酵的变温培养
问题的提出
接种后10h左右已进入对数生长期,随后是10h左右的加速生长期,在40h左右对数生长期基本完成,在50h左右转入生产期
主要问题:
如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期
适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在
变温培养的正交设计
结论:前60h按31℃控制,缩短了适应期使发酵提前转入生产阶段,同时菌丝体已有相当量的积累,为大量分泌抗生素提供了物质基础
60小时后将罐温降至3O℃使与抗生素合成有关的酶的活性增强,抗生素分泌量有所增加,同时因分泌期的延长有利于进一步积累抗生素
发酵进入后期罐温再回升至31℃ 使生产菌在生命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物.
2)根据培养条件选择
温度选择还要根据培养条件综合考虑,灵活选择.
通气条件差时可适当降低温度,使菌呼吸速率降低些,溶氧浓度也可髙些.
培养基稀薄时,温度也该低些.因为温度高营养利用快,会使菌过早自溶.
3)根据菌生长情况
菌生长快,维持在较高温度时间要短些;菌生长慢,维持较高温度时间可长些.培养条件适宜,如营养丰富,通气能满足,那么前期温度可髙些,以利于菌的生长.
总的来说,温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑.要通过反复实践来定出最适温度.
利用温度控制提高产量的实例:热冲击处理技术提高发酵甘油的产量
实验:正交条件
A 冲击温度(0C) 40,45,50
B 开始时机(h) 8,16,30
C 冲击时间(分) 15,30,60
结果发酵16小时,450C冲击30分钟最佳,发酵96小时后甘油浓度提高32.6%.
(A)16h,450C,30min
(B)12h,450C,30min
第二节 pH值的控制
1 pH值对菌体生长和代谢产物形成的影响
pH表示溶液氢离子浓度的负对数,纯水的[H+]浓度是10-7mol/L,因此pH为7,pH>7呈碱性,pH5.0时,易染细菌;
pH 7.5时,稳定性下降,半衰期缩短,发酵单位也下降.青霉素在碱性条件下发酵单位低,也与青霉素的稳定性有关.
2 影响pH值变化的因素
在发酵过程中,pH值的变化决定于所用的菌种,培养基的成分和培养条件.在产生菌的代谢过程中,菌体本身具有一定的调整周围环境pH值,构建最适pH值的能力.

以产生利福霉素SV的地中海诺卡菌进行发酵研究,采用pH值为6.0,6.8,7.5三个出发值,结果发现:
pH值在6.8,7.5时,最终发酵pH值都达到7.5左右,菌丝生长和发酵单位都达到正常水平;
pH值为6.0时,发酵中期pH值只达4.5,菌浓仅为20%,发酵单位为零.
这说明菌体仅有一定的自调能力.
1)基质代谢
(1)糖代谢 特别是快速利用的糖,分解成小分子酸,醇,使pH下降.糖缺乏,pH上升,是补料的标志之一
(2)氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降;尿素被分解成NH3,pH上升,NH3利用后pH下降,当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升.
(3)生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降
如灰黄霉素发酵的pH值变化,就与所用碳源种类有密切关系,如以乳糖为碳源,乳糖被缓慢利用,丙酮酸堆积很少,pH值维持在6～7之间;如以葡萄糖为碳源,丙酮酸迅速积累,使pH值下降到3.6,发酵单位很低.
2)产物形成
某些产物本身呈酸性或碱性,使发酵液pH变化.如有机酸类产生使pH下降,红霉素,洁霉素,螺旋霉素等抗生素呈碱性,使pH上升.
3)菌体自溶,pH上升,发酵后期,pH上升.
引起发酵液pH值变化的常见因素
(1)下降
①培养基中C/N不当,有机酸积累;
②消沫油加得过多;
③生理酸性物质过多;
(2)上升
①C/N比例不当,N过多,氨基氮释放;
②生理碱性物质过多;
③中间补料时碱性物加入量过大;
发酵液的pH值变化是菌体代谢反应的综合结果.
从代谢曲线的pH值变化就可以推测发酵罐中的各种生化反应的进展和pH值变化异常的可能原因.
在发酵过程中,要选择好发酵培养基的成分及其配比,并控制好发酵工艺条件,使pH值稳定维持在最佳的范围内.
4 发酵过程中pH值的调节及控制
1) 发酵pH值的确定(范围,时间)
一般是在5～8之间,如谷氨酸发酵的最适pH值为7.5～8.0.
随菌种和产品不同而不同.同一菌种,生长最适pH值可能与产物合成的最适pH值是不一样的.
按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH,使产量最大.
例 pH对林可霉素发酵的影响
林可霉素发酵开始,葡萄糖转化为有机酸类中间产物,发酵液pH下降,待有机酸被生产菌利用,pH上升.若不及时补糖,(NH4)2SO4或酸,发酵液pH可迅速升到8.0以上,阻碍或抑制某些酶系,使林可霉素增长缓慢,甚至停止.对照罐发酵66小时pH达7.93,以后维持在8.0以上至115小时,菌丝浓度降低,NH2-N升高,发酵不再继续.
发酵15小时左右,pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3,调节这一段的pH值至7.0左右,以后自控pH,可提高发酵单位.
pH
7.0
t
不调pH
调pH
效价
pH
黑曲霉pH2～3时合成柠檬酸,pH值接近中性时积累草酸.
谷氨酸生产菌在中性和微碱性条件下积累谷氨酸,在酸性条件下形成谷氨酰胺.谷氨酸发酵在不同阶段对pH值的要求不同,发酵前期控制pH7.5左右,发酵中期pH7.2左右,发酵后期pH7.0,在将近放罐时,pH6.5～6.8为好.
梭状芽孢杆菌丙酮丁醇发酵,pH值在中性时,菌种生长良好,但产物产量很低,实际发酵最适pH值为5～6.
链霉素产生菌生长最适pH值为6.2～7.0,合成最适pH值为6.8～7.3.
最适pH值的确定:根据实验结果
不同的pH值出发进行发酵,发酵过程中定时测定和调节pH值以维持出发pH值,或者利用缓冲液配制培养基来维持.定时观察菌体的生长情况,以菌体生长达到最高值的pH值为生长最适pH.
同样的方法可测得产物合成的最适pH值.但同一产物的最适pH值,还与所用的菌种,培养基组成和培养条件有关.
确定发酵最适pH值时,要考虑温度的影响.
最佳pH的确定
配制不同初始pH的培养基,摇瓶考察发酵情况
pH对产海藻酸裂解酶的影响
pH对海藻糖水解酶产生的影响
pH——菌浓 pH——酶活
pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响
在各种类型的发酵过程中,实验所得的最适pH值,菌体的比生长速率(μ)和产物比生成速率(Qp)等3个参数的相互关系有四种情况(见图10-1):
① μ和Qp的最适pH值都在一个相似的较宽的适宜范围内(a),这种发酵过程易于控制;
② Qp (或μ)的最适pH值范围窄,而μ(或Qp)的范围较宽(b);
③ μ和Qp对pH值都很敏感,它们的最适pH值又是相同的(c),第二,第三种情况的发酵pH值应严格控制;
④ μ和Qp有各自的最适pH值(d),应分别严格控制各自的最适pH值,才能优化发酵过程.
在发酵过程中,发酵液的pH随着微生物活动而不断变化,为提供菌体适宜的生长或产物积累的pH值,需要对发酵生产过程各阶段的pH值实施控监控,实际生产中,从以下几个方面进行:
(一)调整培养基组分:适当调整C/N比,使盐类与碳源配比平衡,一般情况:C/N高时(真菌培养基),pH降低;C/N低时(一般细菌),经过发酵后,pH上升
在生产上,主要的过程控制方法有:
①添加CaCO3:当用NH4+盐作为氮源时,可在培养基中加入CaCO3,用于中和NH4+被吸收后剩余的酸.
②氨水流加法:氨水可以中和发酵中产生的酸,且NH4+可作为氮源,供给菌体营养.通氨一般是使压缩氨气或工业用氨水(浓度20%左右),采用少量间歇添加或连续自动流加,可避免一次加入过多造成局部偏碱.氨极易和铜反应产生毒性物质,对发酵产生影响,故需避免使用铜制的通氨设备.
③尿素流加法:味精厂多用,尿素首先被菌体尿酶分解成氨,氨进入发酵液,使pH上升,当NH4+被菌体作为氮源消耗并形成有机酸时,发酵液pH下降,这时随着尿素的补加,氨进入发酵液,又使发酵液pH上升及补充氮源,如此循环,致至发酵液中碳源耗尽,完成发酵.
氨基酸发酵常用此法.这种方法既可以达到稳定pH值的目的,又可以不断补充营养物质,特别是能产生阻遏作用的物质.少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用,提高产物产量.也就是说,采用补料的方法,可以同时实现补充营养,延长发酵周期,调节pH值和培养液的特性(如菌浓等)等几个目的.
pH的控制方法
常用方法

调节好基础料的pH.基础料中若含有玉米浆,pH呈酸性,必须调节pH.若要控制消后pH在6.0,消前pH往往要调到6.5-6.8
在基础料中加入维持pH的物质,如CaCO3 ,或具有缓冲能力的试剂,如磷酸缓冲液等
通过补料调节pH
在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料.在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH,如
(1)调节补糖速率,调节空气流量来调节pH
(2)当NH2-N低,pH低时补氨水;当NH2-N低,pH高时补(NH4)2SO4
当补料与调pH发生矛盾时,加酸碱调pH
应急措施:
改变搅拌转速或通气量,以改变溶解氧浓度,控制有机酸的积累量及其代谢速度;
改变温度,以控制微生物代谢速度;
改变罐压及通气量,降低CO2的溶解量;
改变加油或加糖量等,调节有机酸的积累量;
分别在4种缓冲介质中,于pH 6.50一9.50测定天冬酰胺酶酶活力.
1 甘氨酸介质pH 8.00时酶活力最高;
2 硼酸在pH 8.50,酶反应最快
3 磷酸在pH 8.50,酶反应最快
4 Tris在pH 8.50,酶反应最快
酶活1>2>4>3
5,不同调pH方法的影响
天冬酰胺酶
不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮氨酸摇瓶发酵的影响,结果如图所示. "1"表示只加CaC03控制pH值,"2"表示只加尿素控制,"3"表示CaC03和尿素联合控制pH值.
异亮氨酸发酵
例:pH对L-异亮氨酸发酵的影响
菌株最适生长pH控制在6.8～7.0
6 发酵的不同阶段采取不同的pH值
pH6.9时,菌体生长旺盛,pH7.15时,对菌体的产酸有利.因此,在发酵的产酸期产酸较高.采用阶段pH控制模式进行发酵,在发酵中前期控制pH6.9,到48h后pH值为7.15,到80h后pH值为7.25.产率22.27g·/L,产酸率提高12.23%.
例:克拉维酸发酵中pH变换控制
问题:在pH低时菌体生长受抑制,在高pH时克拉维酸要分解
用2.5升罐进行的不控制pH的发酵发现,前期由于微生物产生的酸性副产物和有机酸使pH降至6.5.在达到最高细胞浓度后,pH开始从6.5升至8.3.CA产量达最高水平时,pH不再升高.在发酵终止时,pH再次升至8.5.随着pH升高,CA迅速分解.
pH8.0时生长良好
产量低,产物降解
pH7.0时的状况
研究不同pH对发酵的影响
分别配置pH为6.0,7.0,8.0的培养基测定菌的生长和产物合成
pH6.0时,生长受抑制,产物降解少
控制pH7.0和8.0时,最高细胞浓度接近相同(约16%PMV),但控制pH6.0时细胞生长受抑制.
在2.5升生物反应器内,
不控制pH时2.47μg/(mL·h )
控制pH7.0时的产率3.37μg/(mL·h) 最高
控制pH8.0时,产率2.02μg/(mL·h)
在控制pH6.0时,CA产生被抑制,但降解少
因此对细胞生长和CA产生最好将pH控制于7.0,但在控制pH7.0时,仍出现CA的迅速分解.
由于CA生产的最适pH和减少CA分解的pH各不相同,因此在分批发酵中应用了pH变换策略,使发酵pH由中性pH7.0变换为酸性pH6.0.
在发酵前期,在细胞生长和产生CA期间控制pH7.0,4d后,当CA产量达最高值时,变换pH为6.0,以减少CA分解.最高CA浓度可保持24h.由于改变pH,使CA分解速率明显降低.
小 结
发酵过程pH会发生变化
基质代谢
产物形成
菌体自溶
pH
pH影响酶的活性
pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变
pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离
pH影响代谢方向
pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响
pH的控制方式
基础培养基调节pH
在基础料中加入维持pH的物质
通过补料调节pH
当补料与调pH发生矛盾时,加酸碱调pH
选择合适的pH调节剂
发酵的不同阶段采取不同的pH值
第三节 泡沫的控制
1 泡沫的产生,性质及变化
形成条件:
气-液两相共存;
表面张力大的物质存在;
发酵过程中泡沫有两种类型:
一种是发酵液液面上的泡沫,气相所占的比例特别大,与液体有较明显的界限,如发酵前期的泡沫;
另一种是发酵液中的泡沫,又称流态泡沫(fluid foam),分散在发酵液中,比较稳定,与液体之间无明显的界限.
实质:气溶胶构成的胶体系统,其分散相是空气和代谢气,连续相是发酵液,泡沫间隔着一层液膜而被彼此分开不相连通.
泡沫是热力学不稳定体系
热力学第二定律指出:自发过程,总是从自由能较高的状态向自由能较低的状态变化.起泡过程中自由能变化如下:
△G=γ△A
△G——自由能的变化
△A——表面积的变化
γ——比表面能
起泡时,液体表面积增加,△A为正值,因而△G为正值,也就是说,起泡过程不是自发过程.另一方面,泡沫的气液界面非常大.
例如:半径1cm厚0.001cm的一个气泡,内外两面的气液界面达25cm2;可是,当其破灭为一个液滴后,表面积只有0.2cm2,相差上百倍.
泡沫破灭,合并的过程中,自由能减小的数值很大.因此泡沫的热力学不稳定体系,终归会变成具有较小表面积的无泡状态.
发酵过程泡沫产生的原因
(1)通气搅拌的强烈程度
发酵前期培养基成分丰富,易起泡.
采用较小通气量及搅拌转速,再逐步加大.
也可在基础料中加入消泡剂.
(2)培养基配比与原料组成
前期培养基营养丰富粘度大,产泡沫多而持久.
例:在50L罐中投料10L,成分为淀粉水解糖,豆饼水解液,玉米浆等,搅拌900 rpm,通气,泡沫生成量为培养基的2倍.如培养基适当稀一些,接种量大一些,生长速度快些,前期就容易搅拌开.
(3)菌种,种子质量和接种量
菌种质量好,生长速度快,可溶性氮源较快被利用,泡沫产生几率也就少.菌种生长慢的可以加大接种量
(4)灭菌质量
培养基灭菌质量不好,糖氮被破坏,抑制微生物生长,使种子菌丝自溶,产生大量泡沫,加消泡剂也无效.
泡沫的形成一般有以下几种规律:
整个发酵过程中,泡沫保持恒定的水平;
发酵早期,起泡后稳定地下降,以后保持恒定;
发酵前期,泡沫稍微降低后又开始回升;
发酵开始起泡能力低,以后上升;
泡沫体系的三阶段变化
(1)气泡大小分布的变化
液膜包裹的一个气泡,就像一个吹鼓了的气球.由于气球膜有收缩力,所以气球中压力大于气球外的压力;同样气泡膜有表面张力,气泡中压力大于气泡外的压力.气泡大小的再分布,就是由气泡膜内气体的压力变化引起的.气泡中气体压力的大小,依赖气泡膜的曲率半径
(2)气泡液膜变薄
取一杯泡沫,放置一段时间,就会在杯底部出现一些液体,而逐渐形成液相及液面上的泡沫相这样具有界面的两层.底部出现的液体一部分是泡沫破灭形成的,一部分是气泡膜变薄,排出液体形成的.
泡沫生成初期,泡沫液还比较厚,以后因蒸发排液而变薄,泡沫液会受重力的影响向下排液,泡沫液随时间延续而变薄.
(3)泡沫破灭
泡沫由于排液,液量过少,表面张力降低,液膜会急剧变薄,最后液膜会变得十分脆弱,以至分子的热运动都可以引起气泡破裂.因此只要泡沫液变薄到一定程度,泡沫即瞬间破灭.
泡沫层内部的小气泡破灭后,虽一时还不能导致气液分离,只是合并成大气泡,但排液过程使泡膜液量大幅度减少,使合并成的大气泡快速地破灭,最后泡沫体系崩溃,气液分离.
影响泡沫稳定性的因素
引起危害,需要消除的,只是稳定的泡沫.泡沫的稳定性受液体,气体许多性质的影响.不同介质的泡沫,稳定程度相差很多,影响泡沫稳定性的因素十分复杂,概括国内外研究者的说法,主要因素一下几种
1)泡径大小
大泡易于破灭,寿命较长的的都是小泡.
因为:
泡越小,合并成大气泡的历程就越长;
小气泡的泡膜中所含液量相对比较大,所以较能经受液体流失所造成的稳定性的损失;
气泡越小,上升速度越慢,给表面活性剂的吸附提供充足的时间,增加了稳定性.
2)溶液所含助泡物的类型和浓度
(1)降低表面张力
降低表面张力会降低相邻气泡间的压差.压差小,小泡并入大泡的速度就慢,泡沫的稳定性就好.
(2)增加泡沫弹性
助泡的表面活性剂,吸附在气液界面上,使表面层的组分与液相组分产生差别,因而使泡沫液具有弹性.
(3)助泡剂浓度
溶液中助泡剂浓度增加,气液界面上的吸附量就增加,液膜弹性随之增加,泡沫稳定性增高.
到达临界胶束浓度后,气液界面上的定向排列"饱和",弹性不会再增加.
3)起泡液的粘度
某些溶液,如蛋白质溶液,虽然表面张力不高,但因粘度很高,所产生的泡沫非常稳定.因为粘稠的液膜,有助于吸收外力的冲击,起到缓冲的作用,使泡沫能持久一些.液体粘度对泡沫稳定性的影响比表面张力的影响还要大.
4)其它
*温度 表面张力最低值时的浓度随温度变化.
*pH 影响助泡剂的溶解度和表层的吸附状态
*表面电荷 离子型表面活性剂,由于离子间静电的排斥,阻碍着离子彼此接近,减少排液速度,延缓泡沫变薄过程,使泡沫稳定.
2 泡沫对发酵的影响
1)降低生产能力
在发酵罐中,为了容纳泡沫,防止溢出而降低装量
2)引起原料浪费
如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地,气泡会引起原料流失,造成浪费.
3) 影响菌的呼吸
如果气泡稳定,不破碎,那么随着微生物的呼吸,气泡中充满二氧化碳,而且又不能与空气中氧进行交换,这样就影响了菌的呼吸.
4) 引起染菌
由于泡沫增多而引起逃液,于是在排气管中粘上培养基,就会长菌.随着时间延长,杂菌会长入发酵罐而造成染菌.大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封,轴封处的润滑油可起点消泡作用,从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染.
3 泡沫的控制
泡沫的控制,可以采用三种途径:
① 调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原材料)或改变某些物理化学参数(如pH值,温度,通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制,以减少泡沫形成的机会.但这些方法的效果有一定的限度.
② 采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫:通过化学方法,降低泡沫液膜的表面张力,使泡沫破灭;利用物理方法,使泡沫液膜的局部受力,打破液膜原来受力平衡而破裂.
③ 采用菌种选育的方法,筛选不产生流态泡沫的菌种,来消除起泡的内在因素
如:杂交选育不产流态泡沫的土霉素生产菌株
对于已形成的泡沫,工业上可以采用机械消泡和化学消泡剂消泡或两者同时使用消泡.
化学消泡
这是利用外界加入消泡剂,使泡沫破裂的方法.消泡剂都是表面活性剂,具有较低的表面张力,或者是降低泡沫液膜的机械强度,或者是降低液膜的表面黏度,或者兼有两者的作用,达到破裂泡沫的目的.如聚氧乙烯氧丙烯甘油(GPE)的表面张力仅为3.3×10-2 N/m,而青霉素发酵液的表面张力为(6.0～6.8)×10-2 N/m.
1)消泡剂的作用机理
为了弄清消泡剂如何发挥作用,为了合理,有效地使用消泡剂,需要了解消泡剂的作用机制及一般性质.
分别介绍在消泡剂发展历史上有重要地位的罗氏假说以及其它几种消泡剂的作用机理.
铺展系数S:S=σF-σFA-σA
σF——起泡介质的表面张力
σFA——消泡剂与起泡介质的界面张力
σA——消泡剂的表面张力
以铺展系数S值的正负判断消泡剂是否能够在泡沫上扩展.
σA
σFA
σF
浸入系数E:E=
以浸入系数E值的正负判断消泡剂能否进入泡沫表面.
σA
σFA
σF
美国胶体化学家罗斯(Ross,S.)提出假说:
在溶液中,溶解状态的溶质是稳泡剂;不溶状态的溶质,当浸入系数与铺展系数均为正值时即是消泡剂.
罗斯认为,消泡剂的分子团,即一小滴,一接触泡沫,首先便是浸入,之后在泡沫上扩展,局部变薄而破裂.当浸入系数和铺展系数均为负值时,小滴既不浸入也不扩展;当浸入系数大于零,铺展系数为负数时小滴成棱镜状,不铺展;只有二者均为正值时才可能是消泡剂,这种假说为消泡剂作用机理奠定了基础.
2)与稳泡因素有关的几种消泡机理
a,消泡剂可使泡沫液局部表面张力降低,因而导致泡沫破灭
希勒(Shearer,L.T)和艾克斯(Akers,W.W.)在油体系中研究聚硅氧烷油的消泡过程.他们对泡沫体系以1/1000秒的速度连续拍照,照片放大100倍
由图可以看出,硅油微粒到达泡沫表面使泡沫破灭,气泡合并,气液迅速分离.
研究发现:低浓度的,表面张力比起泡液低的物质,如果与起泡液成为均相,则促进起泡;如果呈饱和状态,而且被均匀分散在起泡液中,就可能有消泡作用.附着了消泡剂小滴的泡沫能够迅速破灭,与局部降低表面张力有关.
日本高野信之提出类似的观点:在起泡液中分散的消泡剂颗粒,随着泡沫液变薄,露到表面,因消泡剂表面张力比泡沫液低,该处受到周围的拉伸,牵引.不断变薄,最后破灭.
把高级醇或植物油洒在泡沫上,当其附着到泡沫上,即溶入泡沫液,会显著降低该处的表面张力.因为这些物质一般对水的溶解度较小,表面张力降低只限于局部,而泡沫周围的表面张力几乎没有发生变化.表面张力降低的部分,被强烈地向四周牵引,延展,最后破裂.
b,消泡剂能破坏膜弹性而导致气泡破灭
稳泡因素中谈到,因泡膜表面吸附表面活性剂具有斯弹性,当受到外部压力时有自愈作用.消泡剂能破坏泡膜的这种弹性.离子型表面活性剂水溶液产生的泡沫,是因为表面活性剂定向排列形成双电层,借助排斥作用阻碍泡沫合并而使泡沫稳定.
这种性质的泡沫,只需向体系中加入一种离子电荷相反的表面活性剂,甚至本身也是助泡剂,就可降低泡沫稳定性.这是因为两种表面活性剂彼此干扰,妨碍在气液界面上定向排列,破坏了膜弹性,因而产生消泡作用.
C,消泡剂能促使液膜排液,因而导致气泡破灭
泡沫液厚泡沫弹性好,自愈效应强;泡膜排液速率反映泡沫的稳定性.起泡体系的粘度越高,排液速度越低,如蛋白质溶液,肽链之间能够形成氢键;有些表面活性剂能与水分子形成氢键,能减少泡沫中的排液,起到稳泡作用.
加入不产生氢键的表面活性剂,取代产生氢键的表面活性剂,就可以使排液加快.
d 表面活性剂吸附层与泡膜上两吸附层当中的泡膜液之间亲和力的强弱;
表面活性剂的HLB值反映这种亲和性,高HLB的表面活性剂,亲水性强,易于使吸附层之间的水随着迁移,是稳泡剂;低HLB值的表面活性剂,亲水性弱,不易使吸附层之间的水随着迁移,往往是消泡剂.
亲水性弱的低HLB值的表面活性剂取代了亲水性强的高HLB值的表面活性剂,能使泡膜吸附层之间的水不随吸附层迁移,从而促进泡膜排液,起到消泡作用
破泡剂与抑泡剂的区别
(1)消泡剂可分为破泡剂和抑泡剂
破泡剂:是加到已形成的泡沫中,使泡沫破灭的添加剂.如低级醇,天然油脂.一般来说,破泡剂都是其分子的亲液端与起泡液亲和性较强,在起泡液中分散较快的物质.这类消泡剂随着时间的延续,迅速降低效率,并且当温度上升时,因溶解度增加,消泡效率会下降.
抑泡剂:是发泡前预先添加而阻止发泡的添加剂.聚醚及有机硅等属于抑泡剂.一般是分子与气泡液亲和性很弱的难溶或不溶的液体
(2)作用机理上的区别
破泡剂的破泡机理大致有二种.
第一,吸附助泡剂,加入电解质,瓦解双电层,及使助泡物被增溶等机理,这样就破坏助泡物的稳泡作用.在这些过程中消泡剂发挥一次消泡作用就被消耗.同时消耗掉相应的助泡物.
第二,低级醇等溶解性较大的消泡剂,加到气泡液中局部降低表面张力,发挥破泡作用,同时本身不断破为碎块,陆续溶解而失去破泡作用.破泡过程中,破泡剂不断失效,消耗,而助泡剂却不受影响
抑泡机理:一般认为抑泡剂分子在气液界面上优先被吸附,它比助泡剂的表面活性更强,更易吸附到泡膜上,但是由于本身不赋予泡膜弹性,所以不具备稳泡作用.这样当液体中产生泡沫时,抑泡剂首先占据泡膜,抑制了助泡剂的作用,抑制了气泡.
(3)破泡剂与抑泡剂的相互关系
溶解度大的破泡剂,消泡作用只发挥一次;溶解度小的破泡剂,消泡作用可持续一段时间.如果溶解度进一步降低,即成为抑泡剂.另一方面,破泡剂大量使用,比有抑泡作用,抑泡剂大量使用也比有破泡作用.
1)消泡剂选用依据:
表面活性剂,具有较低的表面张力(内聚力弱),消泡效果明显.
对气-液界面的散布系数必须足够大,才能迅速消泡;
无毒害性,且不影响发酵菌体;不会在使用,运输中引起任何危害;
不干扰各种测量仪表的使用;
在水中的溶解度较小,以保持持久的消泡性能;
应该在低浓度时具有消泡活性;
应该对产物的提取不产生任何影响;
应该对氧传递不产生影响;
能耐高温灭菌.
来源方便,使用成本低;
常用的一些消泡剂:
①天然油脂:
②高碳醇,脂肪酸和酯类:十八醇是常用的一种,它可以单独或与载体一起使用.
③聚醚类;
④硅酮类;主要是聚二甲基硅氧烷及衍生物,无色液体,不溶于水,表面张力低达21dyn/cm(泡敌为33,向日葵油40,青霉素发酵液60-68 dyn/cm).纯聚二甲基硅氧烷的消泡能力低,常加分散剂来提高消泡活性,或乳化剂成乳状液.适用于微碱性发酵,对于微酸性发酵较差.
(1)天然油脂
最早消泡剂,来源容易,价格低,使用简单,一般来说没有明显副作用,如豆油,菜油,鱼油等.
有些油是发酵产物的前体,如豆油是红霉素的前体,鱼油是螺旋霉素的前体.
分子中无亲水基团,在发酵液中难铺展,所以消泡活性差,用量大,一般为发酵液的0.1-0.2%
近年来出于对环境保护的重视,天然产物消泡剂的地位又有些提高,而且还在研究新的天然消泡剂
油的种类:土霉素发酵,豆油,玉米油较好,而亚麻油则会产生不良的作用.
油的质量,新鲜程度:油新鲜,消泡能力强,副作用也小;
植物油与铁离子接触能与氧形成过氧化物,对四环素,卡那霉素的合成不利,故要注意此类油的贮存保管.
a 酒糟榨出液
罗伯茨(Roberts R.T.)发现:全麦芽浸出浆桶中最后倒出的沉积物能破灭泡沫.于是联想到,是否可以由制作全麦芽浸出浆以后的酒糟压榨出有效的消泡剂
经试验,由酒糟中压榨出大约40%液体,在500C真空蒸馏,浓缩19倍,得到可用于麦芽汁发酵过程的消泡剂.效果很好,没有副作用.
经分析证明,酒糟榨出液中存在C8~C18的全部脂肪酸,存在极性类脂物,尤其是卵磷脂等物,这些物质的协同作用下的消泡作用比这些物质单独消泡作用强得多.
b 啤酒花油
研究年发现向啤酒添加1~5ppm啤酒花油是减轻气泡溢出损失的有效措施.紧分析啤酒花油具含有消泡活性的物质有:石竹烯,荷兰芹萜烯,香叶烯和蒎烯等.
(2)聚醚类消泡剂
我国常用甘油三羟基聚醚.六十年代发明此类消泡剂,美国道康宁化学公司首先投产.
它是以甘油为起始剂,由环氧丙烷,或环氧乙烷与环氧丙烷的混合物进行加成聚合而制成的.只在甘油分子上加成聚合环氧丙烷的产物叫聚氧丙烯甘油定名为GP型消泡剂;
在GP型消泡剂的聚丙二醇链节末端再加成环氧乙烷,成为链端是亲水基的聚氧乙烯氧丙烯甘油,也叫GPE型消泡剂(泡敌).按照环氧乙烷加成量为10%,20%,……50%分别称为GPE10,GPE20,……GPE50.
GP:亲水性差,在发泡介质中的溶解度小,适用于稀薄发酵液.其抑泡性能比消泡性能好,适宜用于基础培养基中抑制泡沫的产生.如用于链霉素的基础培养基中,抑泡效果明显,可全部代替食用油,也未发现不良影响,消泡效力一般相当于豆油的60～80倍.
GPE:亲水性好,在发泡介质中易铺展,消泡能力强,作用快,溶解度大,所以消泡活性维持时间短,适用于黏稠发酵液.用于四环类抗生素发酵中消泡效果很好,用量为0.03%～0.035%,消泡能力一般相当于豆油的10～20倍.
GPES型消泡剂:新的聚醚类消泡剂,在GPE型消泡剂链端用疏水基硬脂酸酯封头,便形成两端是疏水链,当中间隔有亲水链的嵌段共聚物.这种结构的分子易于平卧状聚集在气液界面,因而表面活性强,消泡效率高.
其他的消泡剂,如:聚乙二醇等高碳醇消泡剂多适用于霉菌发酵,硅酮类较适用于微碱性的细菌发酵.所以,应结合具体产品发酵,试验上述各种消泡剂的消泡效果,以获得良好的消泡作用.
值得注意的是:消泡剂有选择性.消泡剂用多了有毒性,而且还影响通气和气体分散,因此要少量地加.
消泡的效果
消泡剂:种类,性质,分子量大小,消泡剂亲油亲水基
使用方法:加入方法,使用浓度,温度等
消泡剂的使用有以下几种形式:
①消泡剂 + 载体:惰性载体(如矿物油,植物油等)
②复合消泡剂:如GP和GPE以l:1混合使用于土霉素发酵,结果比单独使用GP的效力提高2倍;
③消泡剂 + 乳化剂:适用于亲水性差的消泡剂.如用吐温80制成的乳剂,用于庆大霉素发酵,效力提高1～2倍.
使用要考虑的因素:
(1)种类的选择:
不影响发酵和提取,能力持久.
(2)用量的选择:0.003-0.025%
(3)方法的选择:
应用之前作比较性试验,找出消沫剂对微生物生理特征影响最小,消沫效率最大的条件;成本.
机械消泡
化学消泡最显著的缺点是影响氧气的溶解,使其减少1/3～1/5,这对微生物供氧极为不利;机械消泡能克服这一缺点,但其应用效果不如化学消泡迅速可靠,不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素.
消泡装置设计依据:①动力小;②结构简单;③易清洁;④运行可靠;⑤维护费用低;
机械消泡
物理学原理;可在罐内或罐外进行.
机械消泡的特点
优点:不需外加物质;节省原材料;减少污染机会.
缺点:不能从根本上消除引起泡沫稳定的原因.
方法
罐外
旋转叶片式
喷雾式
离心式
转向板式
罐内
耙式
旋转圆盘式
流体吹入式
冲击反射板式
碟片式
超声波
离心消泡
小 结
气液接触 气体从外部进入
气体从内部产生
含助泡剂
起泡速度高于破泡速度
通气搅拌
培养基配比与原料组成
菌种,种子质量和接种量
灭菌质量
泡沫的性质: 热力学不稳定体系
泡沫稳定性的因素
泡径大小
溶液所含助泡物的类型
助泡剂浓度
起泡液的粘度
温度, pH,表面电荷 等
降低生产能力
引起原料浪费
影响菌的呼吸
引起染菌
消泡方法:生物法,化学法,机械法
第四节 补料的控制
补料分批发酵(fed-batch culture,FBC):
又称半连续培养或半连续发酵,是指在分批发酵过程中,间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法,是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式,是一种控制发酵的好方法,现已广泛用于发酵工业.
1 FBC的作用
1) 可以控制抑制性底物的浓度
高浓度营养物抑制微生物生长:
① 基质过浓使渗透压过高,细胞因脱水而死亡;
② 高浓度基质能使微生物细胞热致死(themal death),如乙醇浓度达10%时,就可使酵母细胞热致死;
③ 有的是因某种或某些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用,如高浓度苯酚(3%～5%)可凝固蛋白;
④ 高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等.
有的基质是合成产物必需的前体物质,浓度过高,就会影响菌体代谢或产生毒性,使产物产量降低.如苯乙酸,丙醇(或丙酸)分别是青霉素,红霉素的前体物质,浓度过大,就会产生毒性,使抗生素产量减少.
有的底物溶解度小,达不到应有的浓度而影响转化率.如甾类化合物转化中,因它们的溶解度小,使基质的浓度低,造成转化率不高.
采用FBC方式,可以控制适当的基质浓度,解除抑制作用,得到高浓度的产物.
2) 解除或减弱分解代谢物的阻遏
有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏,如葡萄糖阻抑纤维素酶,赤霉素,青霉素等多种酶或产物的合成.通过补料来限制基质葡萄糖的浓度,就可解除酶或其产物的阻遏,提高产物产量.
缓慢流加葡萄糖,纤维素酶的产量几乎增加200倍;将葡萄糖浓度控制在0.02%水平,赤霉素浓度可达905 mg/L;采用滴加葡萄糖的技术,可明显提高青霉素的发酵单位等.这都是利用发酵技术解决分解代谢物阻遏的实际应用.在植物细胞培养中,也采用该技术来提高产量.
3)可以使发酵过程最佳化
分批发酵动力学的研究,阐明了各个参数之间的相互关系.利用FBC技术,就可以使菌种保持在最大生产力的状态.
随着FBC补料方式的不断改进,为发酵过程的优化和反馈控制奠定了基础.
随着计算机,传感器等的发展和应用,已有可能用离线方式计算或用模拟复杂的数学模型在线方式实现最优化控制.
FBC的优点:
①解除底物抑制,产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏;
② 避免一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响,改善发酵液流变学性质;
③ 可提高发芽孢子的比例,控制细胞质量;
④ 不需要严格的无菌条件,产生菌不易老化变异,比连续发酵适用广泛.
2 补料内容
能源和碳源;
氮源;
微量元素;
诱导物;
3 补料的原则
原则:根据菌体生长代谢规律;
生产需要;
环境条件
方法:充足而不过量(少量多次或分批流加)
4 补糖的控制
补糖时机
过早,刺激生长,加速糖利用;
过迟,所需能量跟不上.如谷氨酸发酵在对数生长期的末期补料.
判断:培养基条件,菌种,发酵状况(残糖,pH,菌形态等),在需要时加入;
举例:四环素,P203图10-14
补糖方式
连续流加:每次流加又可分为快速流加,恒速流加,指数速率流加和变速流加.
少量多次间歇补入
大量少次补入

可与其他组分一起进行多组分补料.
以不引起发酵液成分剧烈波动为前提;

补糖量——加入与消耗平衡,维持稳定的糖浓度;
例:
a 四环素发酵还原糖维持在0.8-1.2%
b 谷氨酸追加糖液发酵:在原工艺基础上,加大接种量到10%,增加生物素用量达5μg/L,减少初糖浓度(12%——7-8%)尽快获得大量的生产型菌体,当菌体处在生长对数期后进入产酸期,糖浓度在2%左右时,连续流加糖液,维持2%左右的糖浓度.
优点:低浓度发酵,以利于生长和发酵;
____ 总糖浓度达20%,产酸高.
补糖开始时,不但CRR,OUR大幅度提高,连RQ也提高约10%,表明通过补糖不但提供了更多的碳源,而且随着体系内葡萄糖浓度提高,糖代谢相关酶活力也提高,产能增加.
发酵中后期为保证产生次级代谢产物,有意使菌体处于半饥饿状态,在营养限制的条件下,维持产生次级代谢产物的速率在较高水平.
5 补偿氮源及无机盐
流加尿素,一方面调节pH,另一方面补氮.
谷氨酸发酵时,初次加入尿素量和补加量取决于菌种的脲酶活力强弱和耐尿能力.
脲酶活力低,耐尿素强,初次加入用量多2%,流加次数少
脲酶活力强,耐尿素低,初次加入用量少0.6%,流加以少量多次好
6 补料的控制
流加操作控制系统分为有反馈控制和无反馈控制两类.反馈控制系统是由传感器,控制器和驱动器三个单元所组成.根据控制依据的指标不同,又分为直接方法和间接方法.
间接方法:以溶氧,pH值,呼吸商,排气中CO2分压及代谢产物浓度等作为控制参数.对间接方法来说,选择与过程直接相关的可检参数作为控制指标,是研究的关键.通气发酵利用排气中CO2含量作为FBC反馈控制参数是较为常用的间接方法.
直接法:随着一系列技术障碍的克服,该法将会得到迅速普及.反馈控制的FBC,常常是依据个别指标来进行,在许多情况下,并不能奏效,尚需进行多因子分析.
FBC还可采用"放料和补料"(withdraw and fill)方法:发酵一定时间,产生了代谢产物后,定时放出一部分发酵液(可供提炼),同时补充一部分新鲜营养液,并重复进行.
维持一定菌体生长速率,延长发酵产物生产期,有利于提高产物产量,降低成本.注意染菌.
如控制青霉素生产所用的葡萄糖流加的质量平衡法,就是利用CO2的反馈控制.它是依靠精确测量CO2的释放率CRR和葡萄糖的流动速度,达到控制菌体的比生长速率和菌浓.
pH值也可用作糖的流加控制的参数.
注意事项:
适宜料液比
无菌操作
碳氮平衡,经济合理
第五节 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制
1 菌体浓度对发酵的影响
菌体(细胞)浓度(cell concentration):单位体积培养液中菌体的含量.
反映:菌体细胞的多少,而且反映菌体细胞生理特性不完全相同的分化阶段.
可据此算出菌体的比生长速率和产物的比生成速率等有关动力学参数.
菌体生长的影响因素
遗传特性.取决于细胞结构的复杂性和生长机制,细胞结构越复杂,分裂所需的时间就越长.典型的细菌,酵母,霉菌和原生动物的倍增时间分别为45 min,90 min,3 h和6 h左右,这说明各类微生物增殖速率的差异.
菌体的增长还与营养物质和环境条件有密切关系.各种碳源和氮源等成分和它们的浓度.上限浓度,基质抑制(渗透压,关键酶).一些营养物质的上限浓度(g/L)如下:葡萄糖100,NH4+ 5,PO43- 10.
影响菌体生长的环境条件有温度,pH值,渗透压和水分活度等因素.
菌浓的大小对发酵产物的得率的影响
在适当的比生长速率下,发酵产物的产率与菌浓成正比关系,即 P=QPmc(X)
P——发酵产物的产率(产物最大生成速率或生产率),g/(L·h);
QPm——产物最大比生成速率,h-1;
c(X)——菌体浓度,g/L.
初级代谢产物:菌浓愈大,产物的产量愈大.
次级代谢产物:比生长速率μ比μ临略高一点的最适菌浓[即c(X)临],菌体的生产率最高.
菌浓过高会产生其他的影响:营养物质消耗过快,培养液的营养成分发生明显的改变,有毒物质的积累,溶氧下降,会对发酵产生各种影响.
摄氧速率OUR与传氧速率OTR相平衡时的菌体浓度,即临界菌体浓度c(X)临.菌体超过此浓度,抗生素的比生成速率和体积产率都会迅速下降.
2 基质对发酵影响及其控制
据Monod方程,在分批发酵中菌体比生长速度是基质浓度的函数.在c(S)<10Ks, 接近 max,当 成为 max, S的增加不再影响
在生长偶联型发酵中,趋向Qpmax与 max的变化一致
当 趋向0时( )Qp
随S浓度增加而加大,达到 max时不再受S的影响
当S下降时, 也随之下降
在部分生长偶联型发酵中,产物生成后于生长:当 趋向 max ,然后趋向0时,Qp仍增加直到最大.
Qp与营养物浓度饱和值无关
即营养物浓度不饱和的限制作用只影响 ,而不影响Qp
稳定期前营养物浓度控制目的是保持最大 ,稳定期内营养物浓度控制产物形成最大浓度
在产物生成阶段,菌体不再以几何级数增加,营养物主要用以转化为产物
营养物不足,产物形成少
营养物浓度过高,酶达到饱和,也不会增加产物形成量
营养物也影响代谢调节
举例:基质浓度对生成量和组成的影响
黑曲霉柠檬酸发酵
蔗糖浓度15%~18%,蔗糖同化率97%
蔗糖浓度20%,只同化92%
蔗糖浓度低于10%,产柠檬酸少,积累草酸
蔗糖浓度低于2.5%,不产柠檬酸
营养物比例对发酵的影响
影响菌体按比例,均匀地吸收营养物和环境pH的稳定
影响菌体生长,影响产物量和组成
例:棒杆菌生产谷氨酸
NH4+过量,菌体增殖阶段会抑制菌体生长,产酸阶段Glu会受谷氨酰胺合成酶作用转化为Gln
NH4+不足, -酮戊二酸积累,引起反馈调节
1)碳源对发酵的影响及其控制
迅速利用的碳源能较迅速地参与代谢,合成菌体和产生能量,并产生分解代谢产物,有利于菌体生长,但有的分解代谢产物阻遏产物合成;
缓慢利用的碳源多数为聚合物,为菌体缓慢利用,有利于延长代谢产物的合成.例如,乳糖,蔗糖,麦芽糖,玉米油及半乳糖分别是青霉素,头孢菌素C,盐霉素,核黄素及生物碱发酵的最适碳源.
For 青霉素:
现象:在迅速利用的葡萄糖培养基中,菌体生长良好,但青霉素合成量很少;相反,在缓慢利用的乳糖培养基中,青霉素的产量明显增加.缓慢滴加葡萄糖以代替乳糖,仍然可以得到良好的结果.
说明:糖的缓慢利用是青霉素合成的关键因素.乳糖被缓慢利用的速度恰好适合青霉素合成的要求.
结论:合理使用迅速利用的碳源;
发酵培养基中采用混合碳源.
图7-8 糖对青霉素生物合成的影响试验
碳源的浓度:营养过于丰富对菌体的代谢,产物的合成及氧的传递都会产生不良的影响.若产生阻遏作用的迅速利用的碳源用量过大,则产物的合成会受到明显的抑制;反之,仅仅供给维持量的碳源,菌体生长和产物合成就都停止.
控制碳源的浓度:
经验法:根据不同代谢类型来确定补糖时间,补糖量和补糖方式.
动力学法:根据菌体的比生长速率,糖比消耗速率及产物的比生成速率等动力学参数来控制.
2)氮源对发酵的影响及其控制
影响产物合成的方向和产量
如:
谷氨酸发酵——
NH4+供应不足,促使形成α-酮戊二酸;
NH4+过量,促使谷氨酸转变成谷氨酰胺.
控制适量的NH4+浓度

迅速利用的氮源:氨基(或铵)态氮的氨基酸(或硫酸铵等)和玉米浆等;容易被菌体所利用,促进菌体生长,但对某些代谢产物的合成,特别是某些抗生素的合成产生调节作用,影响产量.如链霉菌的竹桃霉素发酵中,采用促进菌体生长的铵盐浓度,能刺激菌丝生长,但抗生素产量下降.铵盐还对柱晶白霉素,螺旋霉素,泰洛星等的合成产生调节作用.
缓慢利用的氮源:黄豆饼粉,花生饼粉,棉子饼粉等蛋白质.延长次级代谢产物的生产期,提高产物的产量.一次投入全量容易促进菌体生长和养分过早耗尽,以致菌体早衰自溶,缩短产物的生产期.
生产上采用的方法:
设计发酵培养基:选用含有快速利用和慢速利用的混合氮源.
如:氨基酸发酵用铵盐(硫酸铵或醋酸铵)和麸皮水解液,玉米浆;
链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉.
补加有机氮源 酵母粉,玉米浆,尿素等.
如:土霉素发酵,补加酵母粉可提高发酵单位;
青霉素发酵,后期出现糖利用缓慢,菌浓变稀,pH值下降的现象,补加尿素可改善这种状况并提高发酵单位;
氨基酸发酵补加作为氮源和pH值调节剂的尿素.
补加无机氮源:氨水或硫酸铵
氨水:既可作为无机氮源,又可调节pH值.在抗生素发酵工业中,通氨是提高发酵产量的有效措施,如与其他条件相配合,有的抗生素的发酵单位可提高50%左右.
硫酸铵:生理酸性,当pH值偏高而又需补氮时补加,以达到提高氮含量和调节pH值的双重目的.
根据发酵控制的要求选择其他无机氮源.
3 磷酸盐浓度的控制
适当的浓度:取决于菌种特性,培养条件,培养基组成和来源等因素.必须结合当地的具体条件和使用的原材料进行实验确定.
抗生素发酵:生长亚适量(对菌体生长不是最适合但又不影响生长的量)的磷酸盐浓度.
举例:四环素发酵:菌体生长最适的磷浓度为65～70 μg/mL,而四环素合成最适磷浓度为25～30 μg/mL.青霉素发酵:0.01%的磷酸二氢钾为好.
代谢缓慢:补加磷酸盐.
举例:在四环素发酵中,间歇,微量添加磷酸二氢钾,有利于提高四环素的产量.
其他成分:金属离子,微量元素等.
如:Cu2+能促进醋酸转化为谷氨酸;
Mn2+浓度足够才能促进杆菌肽的合成.
营养条件的选择
1)种类的选择
生长阶段:营养物要全面
产物生成阶段:给予发酵所需的各种营养,前体,促进剂
混合氮源和混合碳源
2)浓度
3)比例的选择
根据培养基化学组成和菌体需要
根据动力学原理进行优化 碳氮比
根据营养物特性进行调整
操作方法:
首先要确定基础培养基配方中有适当的配比.
然后通过中间补料来控制:C,N,磷酸盐.
可利用菌体代谢产生的CO2量来控制生产过程的补糖量,以控制菌体的生长和浓度.
第六节 CO2和呼吸商
二氧化碳
微生物的代谢产物
合成产物的一种基质
反映微生物生长和发酵状况,可通过碳质量平衡来估算菌体生长速率和细胞量.
溶解在发酵液中的CO2对氨基酸,抗生素等微生物发酵具有抑制和刺激作用,对许多产物的生产菌亦有影响.
1 CO2对菌体生长和产物形成的影响
CO2对菌体生长的作用:直接影响——排出CO2高于4%时,碳水化合物的代谢及微生物的呼吸速率下降.
举例:发酵液中溶解CO2浓度为1.6×10-2 mol/L时,会严重抑制酵母生长.当进气口CO2含量占混合气体体积的80%时,酵母活力只达到对照组的80%.一般以1 L/(L·min)的空气流量通气发酵,发酵液中溶解CO2只达到抑制水平的10%.
CO2影响产物形成:阻碍基质分解和ATP生成,影响产物的合成.
举例:
CO2分压0.008 MPa,青霉素合成速度降低40%;
氨基糖苷类抗生素紫苏霉素生产:通以1%CO2,微生物对基质的代谢极慢,菌丝增长速度降低,紫苏霉素的产量比对照组降低33%.通入2%CO2,紫苏霉素的产量比对比照组降低85%,CO2的含量超过3%,则不产生紫苏霉素.
CO2影响菌体形态:
产黄青霉菌接种到溶解不同CO2浓度的培养基中,发现:
CO2分压0～8%时,菌丝主要是丝状;
CO2分压15%～22%,则膨胀,粗短的菌丝占优势;
CO2为0.008 MPa时,则出现球状或酵母状细胞,致使青霉素合成受阻,其比生成速率降低40%左右.
CO2对细胞的作用机制:
CO2作用在细胞膜的脂肪核心部位.
HCO3-影响磷脂,亲水头部带电荷表面及细胞膜表面的蛋白质.
当细胞膜的脂质相中CO2浓度达临界值时,使膜的流动性及表面电荷密度发生变化,导致许多基质的膜运输受阻,影响细胞膜的运输效率,使细胞处于"麻醉"状态,细胞生长受到抑制,形态发生改变.
CO2与发酵环境
大发酵罐中CO2的分压是液体深度的函数,10 m深的发酵罐在0.101 MPa气压下操作,底部CO2分压是顶部CO2分压的2倍.如不提高搅拌转数,CO2就不易排出,在罐底形成碳酸,进而影响菌体的呼吸和产物的合成.
为了排除CO2的影响,必须考虑CO2在培养液中的溶解度,温度及通气情况.CO2溶解度大,对菌生长不利.采用增加罐压的方法来消泡会增加CO2的溶解度.
2 CO2释放率
(Carbon dioxide release ratio,CRR)
对数期菌体生长速率与CO2释放率成正比 :
CRR=QCO2·c(X)
QCO2 ——二氧化碳比释放率,mmol CO2/(g干菌体·h);
c(X)——菌体浓度,g干菌体/L.
3 呼吸商与发酵的关系
测出耗氧速率OUR,计算出呼吸商RQ.
代谢情况不同,RQ不同:
酵母发酵
RQ=1,糖有氧代谢,生成菌体,无产物形成;
RQ>1.1,糖经EMP生成乙醇.
不同基质,菌的RQ不同.
以延胡索酸为基质,RQ=1.44;
以丙酮酸为基质,RQ=1.26;
E. Coli 以琥珀酸为基质,RQ=1.12;
以乳酸为基质,RQ=1.02
以葡萄糖为基质,RQ=1.00.
不同阶段,RQ不同
菌体生长0.909,
青霉素发酵的理论呼吸商: 菌体维持1,
青霉素合成4.
发酵早期,主要是菌生长,RQ<1;
过渡期:维持菌体生命活动,产物逐渐形成,基质葡萄糖的代谢不仅仅用于菌体生长,RQ比生长期略有增加.
产物形成期:对RQ的影响较为明显,如产物还原性比基质大,RQ增加;产物氧化性比基质大,RQ就减少.其偏离程度决定于每单位菌体利用基质所形成的产物量.
RQ是碳能源代谢情况的指示值.
碳能源完全氧化,RQ达到完全氧化理论值
碳能源不完全氧化,RQ异常.
实测RQ值低于理论值
因为:不完全氧化的中间代谢物
存在多种碳源
如青霉素发酵,RQ为0.5～0.7,且随葡萄糖与消泡剂加入量之比而波动.
一些碳能源基质的理论呼吸商
4 CO2浓度的控制
CO2在发酵液中的浓度大小受到许多因素的影响:菌体呼吸强度,发酵液流变学特性,通气搅拌程度,外界压力大小,设备规模大小也有影响.
CO2浓度控制应随它对发酵的影响而定.
CO2抑制产物合成:降低浓度;
CO2促进产物合成:提高浓度.
CO2产生与补料密切相关
青霉素发酵,补糖会增加CO2的浓度和降低培养液的pH值.补加的糖用于菌体生长,菌体维持和青霉素合成产生CO2.增加的CO2和代谢产生的有机酸,又使培养液pH值下降.
因此,补糖,CO2,pH值三者具有相关性,被用于青霉素补料工艺的控制参数,其中排气中的CO2量的变化比pH值变化更为敏感,所以,采用测定CRR作为控制补糖速率参数.
通气搅拌调节CO2的溶解度:在3 m3发酵罐中进行四环素发酵试验,发酵40 h以前,通气量减小到75 m3/h,搅拌为80 r/min,提高CO2的浓度;40 h以后,通气量和搅拌分别提高到110 m3/h和140 r/min,降低CO2浓度,使四环素产量提高25%～30%.
调节罐压也可影响CO2的浓度,对菌体代谢和其他参数也产生影响.
CO2形成的碳酸,可用除CaCO3以外的碱来中和.
第七节 发酵终点的判断
生产能力(或称生产率,产率)是指单位时间内单位罐体积发酵液的产物积累量而言.
生产率单位一般为g/(L·h)或kg/(m3·h),产物浓度单位为g/L或kg/m3,发酵时间单位为h.
高生产率 + 成本控制
产物形成过程:生长 发酵 衰老
到了衰亡期,菌体的产物分泌能力都要下降,产物的生产率相应下降或停止.有的产生菌在衰亡期,营养耗尽,菌体衰老而进入自溶,释放出体内的分解酶会破坏已形成的产物.
发酵终点的判断原则
根据发酵类型,生产目标,判断发酵终点.
对发酵及原材料成本占整个生产成本主要部分的发酵品种,主要追求提高生产率(kg/m3·h),得率(kg产物/kg基质)和发酵系数(kg产物/罐容积m3·发酵周期h)
下游提取精制成本占主要部分和产品价格比较贵,除了要求高的产率和发酵系数外,还要求高的产物浓度.
合理的放罐时间是由实验来确定的,即根据不同的发酵时间所得的产物产量计算出发酵罐的生产率和产品成本,采用生产率高而成本又低的时间,作为放罐时间.确定合理放罐时间,需考虑下列几个因素:
一,经济因素
以最低的成本来获得最大生产率的时间为最适发酵时间.
缩短发酵周期,设备的利用率提高,但单位体积发酵液的产物产量增长有限
延长时间,平均生产率下降,而动力消耗,管理费用支出,设备消耗等费用仍在增加,因而产物成本增加.
二,产品质量因素
发酵时间太短,残留过多尚未代谢的营养物质,不利于提取,分离.
发酵时间太长,菌体自溶,释放出菌体蛋白或体内的酶,改变发酵液性质,增加过滤难度,延长过滤时间,破坏一些不稳定产物.
太长或太短均会使产物质量下降,含量增加.
三,特殊因素
异常情况:染菌,代谢异常(糖耗缓慢等)
避免损失,挽救.
判断放罐指标:产物浓度,过滤速度,氨基氮,菌丝形态, pH,培养液的外观,粘度
菌体自溶前的迹象:
氨基氮升高, pH升高,菌丝碎片增多,粘度增大,过滤速度降低
放罐临近时,加糖,补料或消泡剂都要慎重,因残留物对提取有影响.补料可根据糖耗速率计算到放罐时允许的残留量来控制.
补充:发酵过程检测与自控
检测目的:
① 了解过程变量的变化是否与预期的目标值相符;
② 决定种子罐移种和发酵罐放罐的时间;
③ 对不可测变量进行间接估计;
④ 对过程变量按给定值进行手动控制或自动控制;
⑤收集建立数学模型必需的数据,通过过程模型实施计算机控制.
代谢参数按性质分可分三类:
物理参数:温度,搅拌转速,空气压力,空气流量,溶解氧,表观粘度,排气氧(二氧化碳)浓度等
化学参数:基质浓度(包括糖,氮,磷),pH,产物浓度,,核酸量等
生物参数:菌丝形态,菌浓度,菌体比生长速率,呼吸强度,基质消耗速率,关键酶活力等
从检测手段分可分为:
间接参数:由直接参数经过计算得到,如摄氧率,KLa等
直接参数:直接测得——温度,pH,残糖等
在线检测参数:不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数,如温度,pH,搅拌转速;
离线检测参数:取出样后测定得到的参数,如残糖,菌体浓度.
发酵过程主要分析的项目
1,pH
微生物代谢状况的综合反映——基质代谢,产物合成,细胞状态,营养状况,供氧状况
2,排气氧,排气CO2和呼吸熵
3,糖含量
反映产生菌的生长繁殖情况
糖的消耗
反映产物合成的活力

糖含量测定

总糖:发酵液中残留的各种糖的总量.如发酵中的淀粉,饴糖,单糖等各种糖.
还原糖:指含有自由醛基的单糖,通常指的是葡萄糖.
4,氨基氮和氨氮
氮利用快慢可揭示:菌体生长情况
含氮产物合成情况
氨基氮:有机氮中的氮(NH2-N),单位是 mg/100ml.如氨基酸中的氮,黄豆饼粉,花生饼粉中都有有机氮.
氨氮:无机氨中的氮(NH3-N).发酵后期氨基氮回升,应及时放罐,以免影响提取过程.
5,磷含量:发酵中用来计算磷含量的是磷酸根.
6,菌浓度和菌形态
菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况.补料引起菌浓的波动,因此也可用来衡量补料量适合与否.
菌形态:显微镜观察
菌浓度:测粘度,压缩体积法(离心),静置沉降体积法,比浊法(适合于细菌,酵母)
7,产物浓度
直接反映了生产的状况,是发酵控制的重要参数.通过计算还可以得到生产速率和比生产速率,从而分析发酵条件如补料,pH对产物形成的影响.
产物量的测定
抗生素效价的表示
抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少,效价大小用单位(U)来表示
效价表示方法:重量折算法
重量单位
类似重量单位
特殊单位
重量折算单位:以最低抑菌浓度为一个单位,如青霉素0.6微克=1U
重量单位:规定某些抗生素活性部分1μg=1u 如链霉素,卡那霉素,红霉素等定义活性部分1μg=1u
类似重量单位:规定抗生素的某种盐1mg=1000u如金霉素,四环素的盐酸盐定一为1μg=1u
特殊单位:药检所制定某些抗生素的单位
制霉菌素 1mg=3700u
多粘菌素B 1mg=10000u
酶活力的表示法
国际统一规定:在250C下,以最适的底物浓度,最适的缓冲液离子强度,以及最适的pH诸条件下,每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位.
产物量测定方法
(1)滴定法:产物能使一定指示剂变色
青霉素:碱性条件下加入过量的I2,反应生成青霉噻唑酸碘,用Na2S2O3滴定多余的碘,可计算出青霉素的单位
柠檬酸可以用NaOH滴定
(2)比色法:产物经一定化学反应产生颜色,且颜色深浅与产物浓度成正比.
淀粉酶活力测定:1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶,所释放出的麦芽糖与生色试剂(3,5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液)产生颜色,它在540nm处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比.
(3)测压法:产物特定反应放出或摄入气体,使系统有压力变化,通过测定压力变化得知产物量.
(4)旋光法:许多酶,抗生素都有不对称碳原子,具有旋光性,因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生素的含量.
谷氨酸
γ-氨基丁酸+CO2
化学和物理方法优点:快速,方便,经常用于过程分析
缺点:存在的杂质会干扰测定结果,因此抗生素成品的测定用生物法测定.
3,生物法
以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准
特点:与临床应用的要求一致
灵敏度高,需用的检品量较小
得到结果比较慢,需经过16~18小时培养
常用于发酵终了产品效价的测定
管碟法简介
"杯"是放被测抗生素的不锈钢小管,小管内径为6mm,高10mm的圆筒形管子,管子的重量尽可能相等.碟是摊布培养基的玻璃培养皿.
在培养中,一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩散,离杯越近,抗生素浓度越大,离杯越远抗生素浓度越小.
随着抗生素浓度减小,有一条最低抑菌浓度带,在带范围内,菌不能生长,而呈透明的圆圈,这就叫"抑菌圈".抗生素浓度越高,抑菌圈越大.
操作方法:
倒平皿,每碟15ml(下层)
冷却到500C左右混入试验菌,将混有菌的培养基5 ml加到已凝固的培养基上待凝固(上层)
在培养基表面垂直放上小杯,在杯中加入待检样品,加满后在37摄氏度培养16~18小时.
管碟法影响因素:
培养基厚度
细菌生长到肉眼所需的时间(菌体及影响菌体生长的条件——接种量,培养温度,及营养环境等)
其它影响因素:上层铺得平整,菌液加入时的温度,钢圈的放置等
抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系
抗生素总量的对数值与抑菌圈半径的平方呈正比
管碟法特点
优点:基本操作,适用于各种抗生素
试验结果较稳定
样品用量少,灵敏度高;
适合于大批样品的测定.
缺点:具有抗菌活性的物质会干扰测定结果;
试验过程长,需第二天才有结果;
需熟练人员才能得到较正确的结果;
杂质会影响扩散速度及效价强度.
思考题
根据微生物对温度的依赖可分类成哪几类微生物
发酵热的定义
生物热的大小与哪些因素有关
温度对发酵有哪些影响
发酵过程温度的选择有什么依据
pH对发酵的影响表现在哪些方面
为了确定发酵的最佳pH,我们该如何实验
发酵过程的pH控制可以采取哪些措施
发酵中泡沫形成的原因是什么 对消泡剂有哪些要求
常用的消泡剂有哪几类
FBC的优点与作用
基质浓度对发酵有何影响 如何进行控制
排气中二氧化碳控制的意义是什么
发酵过程主要分析项目有哪些
参考资料
1.《发酵工程最优化控制》钱铭镛,江苏科学技术出版社,1998
2.《发酵过程优化原理与实践》陈坚,李寅,化学工业出版社,2002.3
End