神马文学网2006年研究生代谢控制发酵试题及答案
来源：百度文库 编辑：神马文学网 时间：2024/05/01 22:23:15
2006年研究生《代谢控制发酵》试题及答案
1.为什么说进行代谢控制分析可以揭示细胞代谢的动态变化规律 (15%)
答:代谢控制分析以生化反应体系的敏感性分析为基础,研究分析代谢控制在各途径之间的分配规律,是一种以系统的观点对细胞内代谢调控进行定量分析的理论和实验方法.代谢控制分析以系统观点对细胞内代谢调控进行定量分析,认为代谢控制是细胞内代谢的系统属性,可以用酶动力学性质进行定量表示,代谢途径中酶促反应步骤对代谢的控制作用随系统内外条件的改变而变化,用理论计算或试验确定的控制系数能够加深对代谢的控制结构特性的理解.代谢控制分析的基本研究对象是由单步反应组成的复杂的代谢网络,其中单步反应步骤是组成系统的基本结构单元.由于代谢系统中所有反应步骤都直接或者间接地对代谢流和代谢物浓度产生影响.因此,对其中任一反应施加轻微的扰动,由此产生的代谢流或代谢物浓度的变化,可以作为该反应步骤对代谢系统控制的度量.代谢控制分析从系统论的角度考察代谢现象,把每个酶促反应作为代谢系统最基本的组成部分,同时将基因表达,酶活水平,代谢物浓度,抑制机制,效应物,抑制剂,激活剂以及环境条件等的影响归结为对反应的扰动,再根据代谢系统的结构特点进行系统综合分析.它的一个重要特点就是结合具体的酶反应动力学性质来分析说明代谢网络特性,如利用与代谢网络中某一步反应具有相同参数的酶促反应的速度方程求导获得弹性系数,或者通过体内实验测定弹性系数;根据连通原理确定代谢网络中的控制系数,从而研究复杂代谢网络的动态变化规律.同时,利用代谢控制分析的连通原理还能进一步推广用来描述代谢物的扰动通过代谢网络的传播的机理.因此,进行代谢控制分析可以揭示细胞代谢的动态变化规律.
2.要系统研究代谢流及其控制机制,必须包括哪些基本步骤 (10%)
答:系统研究代谢流及其控制机制,包括以下几个基本步骤:
(1)建立一种能尽可能多的观察代谢网络并测定其流量的方法.为了做到这一点,通常从测定细胞外代谢产物的浓度入手进行简单的物料平衡.由于一个代谢途径的代谢流并不等于该途径中一个或多个酶的活性,所以酶法分析并不能提供代谢网络真正的代谢流信息,除非相应的酶在体外分析条件下存在并具有活性.因此,在代谢分析中,酶法分析常会错误地显示相似数量级的代谢流,从而导致产生不正确的结论.
(2)在代谢网络中施加一个已知的扰动,以确定在系统松散之后达到新的稳态时的代谢流.常用的扰动方式包括启动子的诱导,底物流加,特定碳源消除或物理因素变化等.一种扰动往往能提供多个节点上的相关信息,这对于精确描述代谢网络控制结构所必需的最小实验量是至关重要的.
(3)系统分析代谢流扰动的结果.如果某个代谢流的扰动对其下游代谢流并未能造成可观察的影响,那么就可以认为该处的节点对上游的扰动是刚性的,相反则成为柔性的.一般地,在刚性节点处,不能通过改变上游酶活性来影响其下游代谢流.
(4)除了上述对代谢途径的物质流和能量流进行分析外,代谢工程还包括信息流分析,如信号转导途径等.
3. 在酿酒酵母培养过程中葡萄糖-6-磷酸,磷酸烯醇式丙酮酸和1,6-二磷酸果糖节点被认为是主要节点.在酿酒酵母培养过程中添加Mg2+,得到如下结果(图);在培养液中添加EDTA和NH+4,得到如下结果(图).试判断葡萄糖-6-磷酸,磷酸烯醇式丙酮酸和1,6-二磷酸果糖节点的刚柔性(15%).
答:通过在酿酒酵母培养过程中添加Mg2+,以改变相应的代谢流量,可以判断葡萄糖-6-磷酸节点的性质.由于葡萄糖-6-磷酸经葡萄糖磷酸异构化生成果糖-6-磷酸的反应是一个典型的可逆反应,因此在稳定态时,葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸的流量接近平衡,这样就可将葡萄糖-6-磷酸代替果糖-6-磷酸,看做为合成1,6-二磷酸果糖的底物.由添加Mg2+前后相关途径的代谢流分配情况可以看出,添加Mg2+能在很大程度上提高代谢途径中各个酶的活性,并使整个代谢流量提高了1倍多.然而,分配进入1,6-二磷酸果糖节点处的流量比率却基本不变,而胞外1,6-二磷酸果糖的流量比率也只从7.3增加到16.1,不到产物理论得率最高时流量的1/3.以上情况说明,Mg2 +添加后对1,6-二磷酸果糖代谢途径的流量分配并没有发生重大变化.另一方面,从无机磷平衡的角度分析,整个代谢过程中还存在大量的高能磷酸化合物,它们阻碍ATP的合成.结果表明,葡萄糖-6-磷酸并不是限制性的底物,而ATP则可能是限速步骤因子,也就是说,葡萄糖-6-磷酸所处的节点是非刚性的.
Mg2+对酿酒酵母糖酵解代谢通量的影响
在发酵液中添加EDTA,减缓1,6-二磷酸果糖的分解速率和葡萄糖的摄取利用速率,可知1,6-二磷酸果糖与ATP的合成是否一致;在发酵液中添加NH+4,以解除ATP等物质对磷酸果糖激酶的抑制作用,通过增加1,6-二磷酸果糖的量,从而刺激磷酸解酮酶的活性,增加ATP的合成.故通过该实验可以验证1,6-二磷酸果糖节点的刚性行为.上述两种情况下的代谢流量分配结果表明,添加EDTA与添加Mg2+相比,代谢途径的整体物质流量下降了近30%,但1,6-二磷酸果糖节点处的流量分配基本没有发生改变;添加NH4Cl后的代谢流量增加了近30%,然而1,6-二磷酸果糖节点处的流量分配也基本没有变化.故可以判断1,6-二磷酸果糖所处的节点也不是刚性的.
酿酒酵母糖酵解代谢途径中1,6-二磷酸果糖节点的柔刚性判断
在前面两组实验中,代谢流量的变化情形与含有刚性节点的依赖型网络的应答相一致,这说明在1,6-二磷酸果糖代谢途径中至少有一个刚性节点.既然葡萄糖-6-磷酸和1,6-二磷酸果糖所处的节点都不是刚性的,因此可推断磷酸烯醇式丙酮酸节点是惟一的刚性节点.事实上,磷酸烯醇式丙酮酸在网络中的独特地位也决定了其节点的性质,它被丙酮酸激酶催化生成丙酮酸和ATP,而后者一方面是丙酮酸激酶的抑制剂,起到抑制磷酸烯醇式丙酮酸分解的作用,另一方面又是果糖-6-磷酸转化为1,6-二磷酸果糖的底物,在一定浓度范围内能激活磷酸果糖激酶.从依赖型网络的刚性特征来看,也可以得出上述结论.
4. 试述代谢设计的实施策略(20%).
答:代谢设计的战略思想主要包括以下几方面.
一,在现存途径中改变目的产物的代谢流
在现存途径中改变目的产物的代谢流可以增加目的产物的积累,一般来讲,在处于正常生理状态下的细胞内,对于某一特定代谢产物的生物合成途径而言,其代谢流变化规律是恒定的.要增加目的产物的积累,可以从以下几个方面入手:
(1)增加代谢途径中限速酶编码基因的拷贝数
将编码限速酶的基因通过基因扩增,增加拷贝数,在宿主中表达以实现目的产物产率的上升.首先,必须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶.然后,将编码限速酶的基因通过酶切等手段,制得特定片段,连接在高拷贝数的载体上,再导入宿主中去表达,进而导致最终产物的产量增加.
(2)强化以启动子为主的关键基因的表达系统
通过强化以启动子为主的关键基因的表达系统,可以实现目的产物产率的提高.在此情况下,重组质粒在受体细胞中的拷贝数并未增加,强启动子只是高效率地促进结构基因的转录,以合成更多的mRNA,并翻译出更多的关键酶分子.
(3)提高目标途径激活因子的合成速率
激活因子是生物体内基因表达的开关,它的存在和参与往往能触发相关基因的正常转录,因此,通过代谢工程方法提高目标途径激活因子的合成速率,从理论上讲能促进目标途径关键酶基因的表达.
(4)灭活目标途径抑制因子的编码基因
灭活目标途径抑制因子的编码基因的目的,就是去除代谢途径中具有反馈抑制或反馈阻遏作用的某些因子或者这些因子作用的DNA靶位点(如操纵子),从而解除其对代谢途径的反馈抑制或反馈阻遏作用,从而提高目标代谢流.
(5)阻断与目标途径相竞争的代谢途径
细胞内各相关途径的偶联是代谢网络的存在形式,任何目标途径必定会与多个相关途径共享同一种底物分子和能量形式.因此,在不影响细胞基本状态的前提下,通过阻断或者降低竞争途径的代谢流,使更多的底物和能量进入目标途径,无疑对目标产物的提高非常有益.
(6)改变分支代谢途径流向
提高代谢分支点某一分支代谢途径的酶活力,使其在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势,就可以提高目的代谢产物的产量.赖氨酸工程菌的构建是改变分支代谢途径流向的一个典型例子.通过克隆二氢吡啶-2,6-二羧酸合成酶基因,所得工程菌可以积累大量赖氨酸.相反,如果将编码高丝氨酸脱氢酶(HD)的基因连接在多拷贝的载体质粒上并克隆,使该基因进行扩增,则代谢流将明显转到合成蛋氨酸和苏氨酸的支路上.
(7)构建代谢旁路
为实现大肠杆菌工程菌株的高密度培养,必须阻断或降低对细胞生长有抑制作用的有毒物质的产生.应用代谢工程的方法,将枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中,构建新的代谢支路,结果可明显改变细胞糖代谢流,使乙酸处于较低水平,从而达到高密度培养目的.
(8)改变能量代谢途径
改变能量代谢途径或电子传递系统也可以有效改变代谢流.例如,将血红蛋白基因导入大肠杆菌或链霉菌中,不仅在限氧条件下可以提高宿主细胞的生长速率,而且也可以促进蛋白质和抗生素合成,这里表达的血红蛋白并不是直接作用于生物合成途径,而是在限氧条件下提高了ATP的产生效率.
二,在现存途径中改变物流的性质
在天然存在的代谢途径中改变物流的性质,主要是指使用原有途径更换初始底物或中间产物,以达到获得新产物的目的.通过以下两种方法可以改变途径物流的性质.
(1)利用酶对前体库分子结构的宽容性
利用某些代谢途径中酶对底物的相对专一性,投入非理想型初始底物(如己糖及其衍生物)参与代谢转化反应,进而合成细胞原本不存在的化合物.
(2)通过基因修饰酶分子以扩展其底物识别范围
在酶对底物的专一性较强的情况下,可以通过蛋白质工程技术修饰酶分子的结构域或功能域,以扩大酶对底物的识别范围和催化范围.在基因水平上通过修饰酶的分子结构,可拓展其对底物的专一性,甚至改变酶的催化部位.
三,在现存途径基础上扩展代谢途径
(1)在宿主菌中克隆,表达特定外源基因可以延伸代谢途径,从而生产新的代谢产物,提高产率.应用代谢工程技术合成维生素C的前体2-酮基古龙酸(2-KLG)是扩展代谢途径的一个实例.
(2)导入外源基因,通过扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来所不能消耗的底物.
四,利用已有途径转移或构建新的代谢途径
在明确了已有的生物合成途径,相关基因以及各步反应的分子机制后,通过相似途径的比较,便可以利用多基因间的协同作用来构建新的代谢途径.
(1)转移多步途径以构建杂合代谢网络
克隆异于自身次级代谢产物的基因可生产具有新结构的代谢产物.将编码某一完整生物合成途径的基因转移到受体细胞中,可以提供具有很大经济价值的生产菌种.它们或者能够提高目的产物的产率,或者允许使用相对廉价的原材料.例如在高产辅酶Q10基因工程菌的构建中,可以利用多种相似途径的细微差别,人工设计出理想的新代谢旁路.
(2)修补完善细胞内部分支途径以合成新的产物
自然界中存在的遗传和代谢多样性提供了一个具有广泛底物吸收谱和产物合成谱的生物群集合,借助于少数几个精心选择的异源基因的拼接,可以将天然代谢物转化为更为优良的最新型产物.
5. 已知谷氨酸棒杆菌中苯丙氨酸的生物合成途径和代谢调节机制如下图所示.试述苯丙氨酸工程菌株的代谢设计策略(25%).
答:苯丙氨酸属于芳香族氨基酸,在生物体内存在严格的调控机制.谷氨酸棒杆菌中苯丙氨酸的生物合成途径和代谢调节机制如图所示.在谷氨酸棒杆菌中,葡萄糖经EMP途径和HMP途径分别生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤藓糖(EP),两者在DAHP合成酶(DS)的催化下生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP).DAHP经三步酶促反应生成莽草酸,莽草酸经三步酶促反应生成分支酸.由分支酸产生两个分支:一方面,在邻氨基苯甲酸合成酶(AS)催化下合成邻氨基苯甲酸,邻氨基苯甲酸在邻氨基苯甲酸磷酸核糖移换酶(PRT),色氨酸合成酶(TS)的催化下合成色氨酸;另一方面,分支酸在分支酸变位酶(CM)的催化下生成预苯酸(PPA).由预苯酸又产生两个分支:在预苯酸脱氢酶(PD)的作用下生成对羟基苯丙酮酸,再生成酪氨酸;在预苯酸脱水酶(PT)的作用下生成苯丙酮酸,最后合成苯丙氨酸.在分支酸处,倾向于优先合成邻氨基苯甲酸;在预苯酸处,倾向于优先合成对羟基苯丙酮酸.
苯丙氨酸工程菌株的代谢设计策略如下:
(1)加速限速反应
苯丙氨酸是由糖代谢中间产物4-磷酸赤藓糖与磷酸烯醇式丙酮酸经过一系列反应合成的,大部分的途径与Tyr和Trp的合成途径一致.苯丙氨酸的合成在许多关键点上受到调控,调控的途径多种多样,第一步被三个同功酶催化,这三种酶分别通过转录途径被产物所调控,酶的活性也受到产物的反馈抑制.这三个酶分别由aroF,aroG,aroH基因所编码,分别受Tyr,phe和Trp调控;合成苯丙氨酸的第二,第三个关键酶是由pheA基因编码的CM/PD酶,它在酶生成水平和酶的活力上受到产物的调控.可通过关键酶基因的克隆表达和去除产物苯丙氨酸的反馈抑制双重手段来加速限速反应.
1)关键酶基因的克隆与表达
在大肠杆菌和棒状杆菌中,关键酶有以下几种:苯丙氨酸氨解酶,DAHP合成酶,分支酸变位酶,预苯酸脱水酶,氨基转移酶.1985年,Ozaki等把一株抗苯丙氨酸类似物的生产菌株谷氨酸棒状杆菌K38染色体上的CM和PD基因克隆进质粒pCE53中,再将重组质粒转回亲株,结果使苯丙氨酸的产量达到19g/L,比亲株提高50%.
2)去除终产物苯丙氨酸的反馈抑制
关键酶的活力对苯丙氨酸的生物合成速率有重要作用,所以必须去除积累的苯丙氨酸对酶的反馈抑制.因为与苯丙氨酸生物合成相关的许多基因都受到tyrR基因编码的阻遏蛋白的调控,通过构建多种tyrR的突变子,并将它们导入生产菌株,从而导致aroF,aroG,aroL和与苯丙氨酸运输和转氨基作用有关的基因等不受抑制,而变为组成型表达.pheA基因同样在基因表达水平上受到调控,而且对它的调控是多方面的.它的启动子受到与苯丙氨酸相作用的特异性抑制蛋白的作用,从而对基因的转录进行调控.
苯丙氨酸前导弱化子序列,在RNA转录的延伸过程中,根据苯丙氨酸的浓度,对转录进行调控.经过基因操作,去除pheA中与调控有关的部分,将剩余的结构基因与新的启动子相连,就可使苯丙氨酸产量大幅度提高.
(2)改变代谢流
代谢前体物的积累途径分为共同途径和分支途径,共同途径为分支途径提供前体物质;对共同途径的研究集中于代谢过程的关键分支点.磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是各个酶系竞争的对象:丙酮酸激酶(PYK)将PEP转化为丙酮酸,PEP羧化酶,PEP羧激酶将PEP和CO2转化为草酰乙酸,DAHP合成酶将PEP和4-磷酸赤藓糖合成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP).例如用同源重组的方法使PYK基因失活,尽量减少PEP流向丙酮酸生成的方向,为DAHP的合成提供更多的原料,结果使构建出的工程菌株的苯丙氨酸产量大幅度提高.
(3)阻断竞争代谢支路
构建自杀型载体,获得Tyr营养缺陷突变株.自杀型载体技术可以将其携带的基因整合到染色体上,在一定的温度(42℃)下,又可以从染色体上切割下来,这种方法的应用,为获得营养缺陷突变株提供了条件.应用这种营养缺陷突变株,可使代谢支路的中间体预苯酸不流向Tyr生成的方向,以使苯丙氨酸的合成有充足的原料.
(4)构建DS酶缺陷的回复突变株,可增加苯丙氨酸的前体物DAHP,因此也有利于苯丙氨酸的生物合成.
(5)加强HMP途径,有利于PEP和EP的生成,从而增加苯丙氨酸合成的前体物,提高苯丙氨酸产生菌的产酸率.
(6)切断进一步代谢途径,通过构建苯丙氨酸酶缺失突变株,苯丙氨酸脱羧酶缺失突变株,苯丙氨酸-tRNA合成酶缺失突变株以及不分解利用苯丙氨酸的突变株,可以减少苯丙氨酸的消耗,从而有利于苯丙氨酸的积累.
(7)生产过程的优化
补料分批培养(fed batch)方式对苯丙氨酸工程菌生长最为有利.在发酵过程中通过不断地加入碳源成分,以保持葡萄糖的浓度,不仅可以提高苯丙氨酸的产量,还可以减少下游分离的难度.在培养过程中,通过加入氨水调节pH值,通入氧气及加强搅拌必不可少.
6. 代谢工程研究过程中必须遵循哪些基本原理 (15%)
答:代谢工程的主要目标是通过定向重组代谢网络,从而达到改良生物体遗传性状的目的.因此,它必须遵循下列基本原理:
(1)必须遵循细胞物质代谢规律及途径组合的生物化学原理,它提供了生物体的基本代谢图谱及其生化反应的分子机理.
(2)必须遵循细胞代谢流及控制分析的化学计量学,分子反应动力学,热力学以及控制学原理,这是代谢途径改造的理论依据.
(3)必须遵循途径代谢流推动力的酶学原理,包括酶促反应动力学,变构抑制效应,修饰激活效应等.
(4)必须遵循基因操作与控制的分子生物学和分子遗传学原理,它们阐明了基因表达的基本规律,同时也提供了基因操作的一整套相关技术.
(5)必须遵循细胞生理状态平衡的细胞生理学原理,它为细胞代谢机制提供了一个全景式的描述,因此是一个代谢速率和生理状态表征研究的平台.
(6)必须遵循发酵或细胞培养的工艺学和工程控制的生化工程和化学工程原理,化学工程是将工程方法运用于生物系统研究的最合适的渠道,这种方法在生物系统的研究中融入了综合,定量,相关等概念,因此在代谢工程领域中具有举足轻重的意义.
(7)必须遵循有关生物信息收集分析与应用的基因组学,蛋白质组学原理,各生物物种的基因物理信息与其生物功能信息在此交汇,并为代谢网络设计提供了更为广阔的展示平台.
1.为什么说进行代谢控制分析可以揭示细胞代谢的动态变化规律 (15%)
答:代谢控制分析以生化反应体系的敏感性分析为基础,研究分析代谢控制在各途径之间的分配规律,是一种以系统的观点对细胞内代谢调控进行定量分析的理论和实验方法.代谢控制分析以系统观点对细胞内代谢调控进行定量分析,认为代谢控制是细胞内代谢的系统属性,可以用酶动力学性质进行定量表示,代谢途径中酶促反应步骤对代谢的控制作用随系统内外条件的改变而变化,用理论计算或试验确定的控制系数能够加深对代谢的控制结构特性的理解.代谢控制分析的基本研究对象是由单步反应组成的复杂的代谢网络,其中单步反应步骤是组成系统的基本结构单元.由于代谢系统中所有反应步骤都直接或者间接地对代谢流和代谢物浓度产生影响.因此,对其中任一反应施加轻微的扰动,由此产生的代谢流或代谢物浓度的变化,可以作为该反应步骤对代谢系统控制的度量.代谢控制分析从系统论的角度考察代谢现象,把每个酶促反应作为代谢系统最基本的组成部分,同时将基因表达,酶活水平,代谢物浓度,抑制机制,效应物,抑制剂,激活剂以及环境条件等的影响归结为对反应的扰动,再根据代谢系统的结构特点进行系统综合分析.它的一个重要特点就是结合具体的酶反应动力学性质来分析说明代谢网络特性,如利用与代谢网络中某一步反应具有相同参数的酶促反应的速度方程求导获得弹性系数,或者通过体内实验测定弹性系数;根据连通原理确定代谢网络中的控制系数,从而研究复杂代谢网络的动态变化规律.同时,利用代谢控制分析的连通原理还能进一步推广用来描述代谢物的扰动通过代谢网络的传播的机理.因此,进行代谢控制分析可以揭示细胞代谢的动态变化规律.
2.要系统研究代谢流及其控制机制,必须包括哪些基本步骤 (10%)
答:系统研究代谢流及其控制机制,包括以下几个基本步骤:
(1)建立一种能尽可能多的观察代谢网络并测定其流量的方法.为了做到这一点,通常从测定细胞外代谢产物的浓度入手进行简单的物料平衡.由于一个代谢途径的代谢流并不等于该途径中一个或多个酶的活性,所以酶法分析并不能提供代谢网络真正的代谢流信息,除非相应的酶在体外分析条件下存在并具有活性.因此,在代谢分析中,酶法分析常会错误地显示相似数量级的代谢流,从而导致产生不正确的结论.
(2)在代谢网络中施加一个已知的扰动,以确定在系统松散之后达到新的稳态时的代谢流.常用的扰动方式包括启动子的诱导,底物流加,特定碳源消除或物理因素变化等.一种扰动往往能提供多个节点上的相关信息,这对于精确描述代谢网络控制结构所必需的最小实验量是至关重要的.
(3)系统分析代谢流扰动的结果.如果某个代谢流的扰动对其下游代谢流并未能造成可观察的影响,那么就可以认为该处的节点对上游的扰动是刚性的,相反则成为柔性的.一般地,在刚性节点处,不能通过改变上游酶活性来影响其下游代谢流.
(4)除了上述对代谢途径的物质流和能量流进行分析外,代谢工程还包括信息流分析,如信号转导途径等.
3. 在酿酒酵母培养过程中葡萄糖-6-磷酸,磷酸烯醇式丙酮酸和1,6-二磷酸果糖节点被认为是主要节点.在酿酒酵母培养过程中添加Mg2+,得到如下结果(图);在培养液中添加EDTA和NH+4,得到如下结果(图).试判断葡萄糖-6-磷酸,磷酸烯醇式丙酮酸和1,6-二磷酸果糖节点的刚柔性(15%).
答:通过在酿酒酵母培养过程中添加Mg2+,以改变相应的代谢流量,可以判断葡萄糖-6-磷酸节点的性质.由于葡萄糖-6-磷酸经葡萄糖磷酸异构化生成果糖-6-磷酸的反应是一个典型的可逆反应,因此在稳定态时,葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸的流量接近平衡,这样就可将葡萄糖-6-磷酸代替果糖-6-磷酸,看做为合成1,6-二磷酸果糖的底物.由添加Mg2+前后相关途径的代谢流分配情况可以看出,添加Mg2+能在很大程度上提高代谢途径中各个酶的活性,并使整个代谢流量提高了1倍多.然而,分配进入1,6-二磷酸果糖节点处的流量比率却基本不变,而胞外1,6-二磷酸果糖的流量比率也只从7.3增加到16.1,不到产物理论得率最高时流量的1/3.以上情况说明,Mg2 +添加后对1,6-二磷酸果糖代谢途径的流量分配并没有发生重大变化.另一方面,从无机磷平衡的角度分析,整个代谢过程中还存在大量的高能磷酸化合物,它们阻碍ATP的合成.结果表明,葡萄糖-6-磷酸并不是限制性的底物,而ATP则可能是限速步骤因子,也就是说,葡萄糖-6-磷酸所处的节点是非刚性的.
Mg2+对酿酒酵母糖酵解代谢通量的影响
在发酵液中添加EDTA,减缓1,6-二磷酸果糖的分解速率和葡萄糖的摄取利用速率,可知1,6-二磷酸果糖与ATP的合成是否一致;在发酵液中添加NH+4,以解除ATP等物质对磷酸果糖激酶的抑制作用,通过增加1,6-二磷酸果糖的量,从而刺激磷酸解酮酶的活性,增加ATP的合成.故通过该实验可以验证1,6-二磷酸果糖节点的刚性行为.上述两种情况下的代谢流量分配结果表明,添加EDTA与添加Mg2+相比,代谢途径的整体物质流量下降了近30%,但1,6-二磷酸果糖节点处的流量分配基本没有发生改变;添加NH4Cl后的代谢流量增加了近30%,然而1,6-二磷酸果糖节点处的流量分配也基本没有变化.故可以判断1,6-二磷酸果糖所处的节点也不是刚性的.
酿酒酵母糖酵解代谢途径中1,6-二磷酸果糖节点的柔刚性判断
在前面两组实验中,代谢流量的变化情形与含有刚性节点的依赖型网络的应答相一致,这说明在1,6-二磷酸果糖代谢途径中至少有一个刚性节点.既然葡萄糖-6-磷酸和1,6-二磷酸果糖所处的节点都不是刚性的,因此可推断磷酸烯醇式丙酮酸节点是惟一的刚性节点.事实上,磷酸烯醇式丙酮酸在网络中的独特地位也决定了其节点的性质,它被丙酮酸激酶催化生成丙酮酸和ATP,而后者一方面是丙酮酸激酶的抑制剂,起到抑制磷酸烯醇式丙酮酸分解的作用,另一方面又是果糖-6-磷酸转化为1,6-二磷酸果糖的底物,在一定浓度范围内能激活磷酸果糖激酶.从依赖型网络的刚性特征来看,也可以得出上述结论.
4. 试述代谢设计的实施策略(20%).
答:代谢设计的战略思想主要包括以下几方面.
一,在现存途径中改变目的产物的代谢流
在现存途径中改变目的产物的代谢流可以增加目的产物的积累,一般来讲,在处于正常生理状态下的细胞内,对于某一特定代谢产物的生物合成途径而言,其代谢流变化规律是恒定的.要增加目的产物的积累,可以从以下几个方面入手:
(1)增加代谢途径中限速酶编码基因的拷贝数
将编码限速酶的基因通过基因扩增,增加拷贝数,在宿主中表达以实现目的产物产率的上升.首先,必须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶.然后,将编码限速酶的基因通过酶切等手段,制得特定片段,连接在高拷贝数的载体上,再导入宿主中去表达,进而导致最终产物的产量增加.
(2)强化以启动子为主的关键基因的表达系统
通过强化以启动子为主的关键基因的表达系统,可以实现目的产物产率的提高.在此情况下,重组质粒在受体细胞中的拷贝数并未增加,强启动子只是高效率地促进结构基因的转录,以合成更多的mRNA,并翻译出更多的关键酶分子.
(3)提高目标途径激活因子的合成速率
激活因子是生物体内基因表达的开关,它的存在和参与往往能触发相关基因的正常转录,因此,通过代谢工程方法提高目标途径激活因子的合成速率,从理论上讲能促进目标途径关键酶基因的表达.
(4)灭活目标途径抑制因子的编码基因
灭活目标途径抑制因子的编码基因的目的,就是去除代谢途径中具有反馈抑制或反馈阻遏作用的某些因子或者这些因子作用的DNA靶位点(如操纵子),从而解除其对代谢途径的反馈抑制或反馈阻遏作用,从而提高目标代谢流.
(5)阻断与目标途径相竞争的代谢途径
细胞内各相关途径的偶联是代谢网络的存在形式,任何目标途径必定会与多个相关途径共享同一种底物分子和能量形式.因此,在不影响细胞基本状态的前提下,通过阻断或者降低竞争途径的代谢流,使更多的底物和能量进入目标途径,无疑对目标产物的提高非常有益.
(6)改变分支代谢途径流向
提高代谢分支点某一分支代谢途径的酶活力,使其在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势,就可以提高目的代谢产物的产量.赖氨酸工程菌的构建是改变分支代谢途径流向的一个典型例子.通过克隆二氢吡啶-2,6-二羧酸合成酶基因,所得工程菌可以积累大量赖氨酸.相反,如果将编码高丝氨酸脱氢酶(HD)的基因连接在多拷贝的载体质粒上并克隆,使该基因进行扩增,则代谢流将明显转到合成蛋氨酸和苏氨酸的支路上.
(7)构建代谢旁路
为实现大肠杆菌工程菌株的高密度培养,必须阻断或降低对细胞生长有抑制作用的有毒物质的产生.应用代谢工程的方法,将枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中,构建新的代谢支路,结果可明显改变细胞糖代谢流,使乙酸处于较低水平,从而达到高密度培养目的.
(8)改变能量代谢途径
改变能量代谢途径或电子传递系统也可以有效改变代谢流.例如,将血红蛋白基因导入大肠杆菌或链霉菌中,不仅在限氧条件下可以提高宿主细胞的生长速率,而且也可以促进蛋白质和抗生素合成,这里表达的血红蛋白并不是直接作用于生物合成途径,而是在限氧条件下提高了ATP的产生效率.
二,在现存途径中改变物流的性质
在天然存在的代谢途径中改变物流的性质,主要是指使用原有途径更换初始底物或中间产物,以达到获得新产物的目的.通过以下两种方法可以改变途径物流的性质.
(1)利用酶对前体库分子结构的宽容性
利用某些代谢途径中酶对底物的相对专一性,投入非理想型初始底物(如己糖及其衍生物)参与代谢转化反应,进而合成细胞原本不存在的化合物.
(2)通过基因修饰酶分子以扩展其底物识别范围
在酶对底物的专一性较强的情况下,可以通过蛋白质工程技术修饰酶分子的结构域或功能域,以扩大酶对底物的识别范围和催化范围.在基因水平上通过修饰酶的分子结构,可拓展其对底物的专一性,甚至改变酶的催化部位.
三,在现存途径基础上扩展代谢途径
(1)在宿主菌中克隆,表达特定外源基因可以延伸代谢途径,从而生产新的代谢产物,提高产率.应用代谢工程技术合成维生素C的前体2-酮基古龙酸(2-KLG)是扩展代谢途径的一个实例.
(2)导入外源基因,通过扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来所不能消耗的底物.
四,利用已有途径转移或构建新的代谢途径
在明确了已有的生物合成途径,相关基因以及各步反应的分子机制后,通过相似途径的比较,便可以利用多基因间的协同作用来构建新的代谢途径.
(1)转移多步途径以构建杂合代谢网络
克隆异于自身次级代谢产物的基因可生产具有新结构的代谢产物.将编码某一完整生物合成途径的基因转移到受体细胞中,可以提供具有很大经济价值的生产菌种.它们或者能够提高目的产物的产率,或者允许使用相对廉价的原材料.例如在高产辅酶Q10基因工程菌的构建中,可以利用多种相似途径的细微差别,人工设计出理想的新代谢旁路.
(2)修补完善细胞内部分支途径以合成新的产物
自然界中存在的遗传和代谢多样性提供了一个具有广泛底物吸收谱和产物合成谱的生物群集合,借助于少数几个精心选择的异源基因的拼接,可以将天然代谢物转化为更为优良的最新型产物.
5. 已知谷氨酸棒杆菌中苯丙氨酸的生物合成途径和代谢调节机制如下图所示.试述苯丙氨酸工程菌株的代谢设计策略(25%).
答:苯丙氨酸属于芳香族氨基酸,在生物体内存在严格的调控机制.谷氨酸棒杆菌中苯丙氨酸的生物合成途径和代谢调节机制如图所示.在谷氨酸棒杆菌中,葡萄糖经EMP途径和HMP途径分别生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤藓糖(EP),两者在DAHP合成酶(DS)的催化下生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP).DAHP经三步酶促反应生成莽草酸,莽草酸经三步酶促反应生成分支酸.由分支酸产生两个分支:一方面,在邻氨基苯甲酸合成酶(AS)催化下合成邻氨基苯甲酸,邻氨基苯甲酸在邻氨基苯甲酸磷酸核糖移换酶(PRT),色氨酸合成酶(TS)的催化下合成色氨酸;另一方面,分支酸在分支酸变位酶(CM)的催化下生成预苯酸(PPA).由预苯酸又产生两个分支:在预苯酸脱氢酶(PD)的作用下生成对羟基苯丙酮酸,再生成酪氨酸;在预苯酸脱水酶(PT)的作用下生成苯丙酮酸,最后合成苯丙氨酸.在分支酸处,倾向于优先合成邻氨基苯甲酸;在预苯酸处,倾向于优先合成对羟基苯丙酮酸.
苯丙氨酸工程菌株的代谢设计策略如下:
(1)加速限速反应
苯丙氨酸是由糖代谢中间产物4-磷酸赤藓糖与磷酸烯醇式丙酮酸经过一系列反应合成的,大部分的途径与Tyr和Trp的合成途径一致.苯丙氨酸的合成在许多关键点上受到调控,调控的途径多种多样,第一步被三个同功酶催化,这三种酶分别通过转录途径被产物所调控,酶的活性也受到产物的反馈抑制.这三个酶分别由aroF,aroG,aroH基因所编码,分别受Tyr,phe和Trp调控;合成苯丙氨酸的第二,第三个关键酶是由pheA基因编码的CM/PD酶,它在酶生成水平和酶的活力上受到产物的调控.可通过关键酶基因的克隆表达和去除产物苯丙氨酸的反馈抑制双重手段来加速限速反应.
1)关键酶基因的克隆与表达
在大肠杆菌和棒状杆菌中,关键酶有以下几种:苯丙氨酸氨解酶,DAHP合成酶,分支酸变位酶,预苯酸脱水酶,氨基转移酶.1985年,Ozaki等把一株抗苯丙氨酸类似物的生产菌株谷氨酸棒状杆菌K38染色体上的CM和PD基因克隆进质粒pCE53中,再将重组质粒转回亲株,结果使苯丙氨酸的产量达到19g/L,比亲株提高50%.
2)去除终产物苯丙氨酸的反馈抑制
关键酶的活力对苯丙氨酸的生物合成速率有重要作用,所以必须去除积累的苯丙氨酸对酶的反馈抑制.因为与苯丙氨酸生物合成相关的许多基因都受到tyrR基因编码的阻遏蛋白的调控,通过构建多种tyrR的突变子,并将它们导入生产菌株,从而导致aroF,aroG,aroL和与苯丙氨酸运输和转氨基作用有关的基因等不受抑制,而变为组成型表达.pheA基因同样在基因表达水平上受到调控,而且对它的调控是多方面的.它的启动子受到与苯丙氨酸相作用的特异性抑制蛋白的作用,从而对基因的转录进行调控.
苯丙氨酸前导弱化子序列,在RNA转录的延伸过程中,根据苯丙氨酸的浓度,对转录进行调控.经过基因操作,去除pheA中与调控有关的部分,将剩余的结构基因与新的启动子相连,就可使苯丙氨酸产量大幅度提高.
(2)改变代谢流
代谢前体物的积累途径分为共同途径和分支途径,共同途径为分支途径提供前体物质;对共同途径的研究集中于代谢过程的关键分支点.磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是各个酶系竞争的对象:丙酮酸激酶(PYK)将PEP转化为丙酮酸,PEP羧化酶,PEP羧激酶将PEP和CO2转化为草酰乙酸,DAHP合成酶将PEP和4-磷酸赤藓糖合成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP).例如用同源重组的方法使PYK基因失活,尽量减少PEP流向丙酮酸生成的方向,为DAHP的合成提供更多的原料,结果使构建出的工程菌株的苯丙氨酸产量大幅度提高.
(3)阻断竞争代谢支路
构建自杀型载体,获得Tyr营养缺陷突变株.自杀型载体技术可以将其携带的基因整合到染色体上,在一定的温度(42℃)下,又可以从染色体上切割下来,这种方法的应用,为获得营养缺陷突变株提供了条件.应用这种营养缺陷突变株,可使代谢支路的中间体预苯酸不流向Tyr生成的方向,以使苯丙氨酸的合成有充足的原料.
(4)构建DS酶缺陷的回复突变株,可增加苯丙氨酸的前体物DAHP,因此也有利于苯丙氨酸的生物合成.
(5)加强HMP途径,有利于PEP和EP的生成,从而增加苯丙氨酸合成的前体物,提高苯丙氨酸产生菌的产酸率.
(6)切断进一步代谢途径,通过构建苯丙氨酸酶缺失突变株,苯丙氨酸脱羧酶缺失突变株,苯丙氨酸-tRNA合成酶缺失突变株以及不分解利用苯丙氨酸的突变株,可以减少苯丙氨酸的消耗,从而有利于苯丙氨酸的积累.
(7)生产过程的优化
补料分批培养(fed batch)方式对苯丙氨酸工程菌生长最为有利.在发酵过程中通过不断地加入碳源成分,以保持葡萄糖的浓度,不仅可以提高苯丙氨酸的产量,还可以减少下游分离的难度.在培养过程中,通过加入氨水调节pH值,通入氧气及加强搅拌必不可少.
6. 代谢工程研究过程中必须遵循哪些基本原理 (15%)
答:代谢工程的主要目标是通过定向重组代谢网络,从而达到改良生物体遗传性状的目的.因此,它必须遵循下列基本原理:
(1)必须遵循细胞物质代谢规律及途径组合的生物化学原理,它提供了生物体的基本代谢图谱及其生化反应的分子机理.
(2)必须遵循细胞代谢流及控制分析的化学计量学,分子反应动力学,热力学以及控制学原理,这是代谢途径改造的理论依据.
(3)必须遵循途径代谢流推动力的酶学原理,包括酶促反应动力学,变构抑制效应,修饰激活效应等.
(4)必须遵循基因操作与控制的分子生物学和分子遗传学原理,它们阐明了基因表达的基本规律,同时也提供了基因操作的一整套相关技术.
(5)必须遵循细胞生理状态平衡的细胞生理学原理,它为细胞代谢机制提供了一个全景式的描述,因此是一个代谢速率和生理状态表征研究的平台.
(6)必须遵循发酵或细胞培养的工艺学和工程控制的生化工程和化学工程原理,化学工程是将工程方法运用于生物系统研究的最合适的渠道,这种方法在生物系统的研究中融入了综合,定量,相关等概念,因此在代谢工程领域中具有举足轻重的意义.
(7)必须遵循有关生物信息收集分析与应用的基因组学,蛋白质组学原理,各生物物种的基因物理信息与其生物功能信息在此交汇,并为代谢网络设计提供了更为广阔的展示平台.