中药色谱指纹图谱鉴别的概念、属性、技术与应用

摘要: 【机构】中南大学中药现代化研究中心，长沙410083【刊名】中药新药与临床药理。-192-200【文摘】目的：对中药色谱指纹图谱的意义和作用进行了讨论，并对中药色谱指纹图谱的定义和特征进行了阐述。方法：从方法学角度对不同层次的中药色谱指纹图谱的特点和作用以及可操作性进行了描述，。结果与结论：色谱指纹谱图研究与中......

【机　构】 中南大学中药现代化研究中心，长沙410083
【刊　名】中药新药与临床药理.2001,12(3).-192-200 
【文　摘】 目的：对中药色谱指纹图谱的意义和作用进行了讨论，并对中药色谱指纹图谱的定义和特征进行了阐述。方法：从方法学角度对不同层次的中药色谱指纹图谱的特点和作用以及可操作性进行了描述，。结果与结论：色谱指纹谱图研究与中药现代化信息相关，中药色谱指纹图谱实验研究与化学计量学的结合具有良好前景。
    自国家药品监督管理局颁发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》(国药管注[2000]348号)以来，中药指纹图谱的研究成为我国中药研究和产业界的热点，对我国中药现代化的研究将起到巨大促进作用。尽管目前对中药色谱指纹图谱的作用与意义还存在各种不同意见，但是，对依靠中药色谱指纹谱固的手段来提高对中药产品的质量控制水平这一点上，意见是比较一致的。本文仅就中药指纹图谱研究的意义和作用等问题，提出几点初浅看法，供国内同行参考。
1  中药指纹图谱的基本含义
    经过多年来的植物化学和药理药效研究，其中特别是近几十年来对中药药效的深入研究，人们越来越认识到中药的药效不是来自单一的活性化学成分，而是来自多种活性成分之间的协同作用，甚至是与某些“非活性成分”的协同效应或“生克作用”。因此，任何单一的活性化学成分或指标成分都难以评价中药的真伪和优劣。利用现代先进的分析技术来分析药材的整体特性，以更准确鉴别不同中药及识别中药本身的真伪和优劣，就形成了中药指纹图谱分析的基础原动力。
    准确地说，中药指纹图谱是不同于我们常规意义的“指纹”含义的，实因常规意义下的指纹强调的是绝对的“个体特异性”，据此可对任何犯罪嫌疑人指证和控罪。恰恰相反，中药指纹图谱赖以鉴别中药的药材真伪和质量优劣所要强调的却是作为药用植物物种的“共有特征性”。更值得指出的是，常规意义的“指纹”分析的依据是主要来源于先天的遗传，而中药药用化学成分的指纹图语分析依据却主要来源于该植物物种后天的代谢产物，且大多为植物的次生代谢物，它对后天的生长环境的依赖性很强，远比纯先天性遗传的“指纹”脆弱得多，故有中药“道地性”和“最佳采集时间”之说。然而，植物的代谢过程仍受其物种先天遗传的影响，所以，利用中药药用化学成分的色谱指纹图谱是完全可以对不同药材种属进行鉴别，对同种药材质量优劣进行评价的。
2  中药指纹图谱的定义和特性
    既然中药指纹图谱将成为一种用来对不同药材种属进行鉴别、对同种药材质量是否均；及其质量优劣进行评价的工具，那么，对其特有属性进行仔细分析，以及为其内涵给出严格定义是很有必要的。
    让我们首先来看一个实际例子。固l是有关肉佳道地性研究的色谱指纹图谱。从上至下，给出了广东肇庆、广西玉林、越南和云南4个不同产地的肉佳挥发油气相色谱(GC—MS)指纹图谱。从此指纹图谱可以看出，它们的形态十分相似，可非常容易地看出它们应届同种药材。然而，若是不同药材．它们的色谱指纹图谱差别则很大，图2显示的厚朴和陈皮的挥发油气相色谱(GC—Ms)指纹图谱即反映了这一点。上述药材的挥发油提取方法均参照中华人民共和国药典1995年版介绍的挥发油提取方法进行，采用GC17A Shimadzu 气相色谱仪和Qp—5000Shimadzu质谱仪测定而得，有关色谱测定的详细条件，读者可参阅文献和文献.值
得指出的是，从我们已分析的近20种中草药样本所得的结果来看，虽然色谱指纹图谱很复杂，有很多峰，且同种药材的指纹图谱也不完全相同，但就像上述两图给出的例子那样，用它们来鉴定同种药材和异种药材及辩认药材真伪的准确度应是相当高的。
    所以，谢培山先生对中药色谱指纹图谱给出了以下定义：
    中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的色谱鉴定手段。借以鉴别真伪，评价原料药材、半成品和成品质量均一性和稳定性。其基本属性是“整体性”和“模糊性”。
    这一定义说明中药色谱指纹图谱是一种综合的、整体的鉴定手段，其功用范围在于鉴别真伪，并还可评价药材的质量均一性和稳定性。从其综合和整体性能看，它可准确且又可量化地对药材进行真伪鉴别和质量评价，而从细节上看，中药色谱指纹图谱又是很模糊的，尤其是因为生药有“道地性”和“采集时间因素”的实际情况，使人很难给出一个对所有药品都适用的共有峰和非共有峰的比例，更不能像西药那样要求一一对应。
个人认为，这个定义确实抓住了中药色谱指纹图谱的实质。
3  不同层次的几种中药指纹图谱及其功用
    如只为纯粹鉴别不同药材，光谱(包括紫外可见、红外甚至近红外光谱)和波谱(包括质谱和核磁共振谱)也可用于作为中药指纹图谱，但是有局限性。我们知道，各类不同的光谱反映了化学成分的不同特性，如紫外可见光谱反映不同化学物质的电子共扼体系特征，红外光谱则反映了不同化学物质的不同基团振动吸收特征等。袁久荣先生曾对不同药材的不同提取液的紫外可见光谱进行过系统研究，发现它们确实可用于鉴别不同药材，所以，在分析化学界也有人主张用光谱来作为中药的指纹图谱。然而，笔者认为，由光谱表征中药的指纹图谱虽可用于鉴别不同药材，却很难像色谱指纹图谱那样．可表达出中药材这样复杂混合体系中各种不同化学成分浓度分布的整体状况。对于中药这样复杂混合体系中的某些组分浓度发生的变化或消长．由于灵敏度和选择性的限制．将难以在光谱上明显而又准确地显示出来“
放将其用于评价药材和各种药品(如注射液)的质量均一性和稳定性时会带来一定困难。国家药品监督管理局在技术要求中推荐使用色谱中药指纹图谱是很有道理的。
    因此，将中药色谱指纹图谱引入作为中药质控手段，对生药培育基地的建设(GAP)，对中药生产工艺的改进和规范(GMP)及中药成品的质量控制(GLP)都产生深远影响。正如任德权先生指出的那样．中药指纹图谱质控技术具有“四两拨千斤”的功效，我们迎来的不仅是中药指纹图谱的质控技术的应用，而且也是整个中药事业、中药产业的现代化。笔者十分赞成这颇具前瞻性的论断。中医药事业现代化和中药产业现代化的本质就在于将中医药理论和实践牢牢植于现代科学所已发现的物质基础之上。而中药色谱指纹图谱质控技术的引入，则正
是我们迈开的坚实的第一步。
    其实，仅就中药色谱指纹图谱而言，也有不同层次的要求。目前，国家药品监督管理局在技术要求中根据我国现有条件，也只提出了利用中药色谱指纹图谱的整体性来定性地对中药进行质控。值得指出的是，近年来，色谱技术本身也在飞速发展，就笔者所知，欧美国家所使用的大都为联用色谱．即将色谱与光谱或波谱联用，如气相色谱与质谱联用仪(GC—MS)，液相色谱与二极管阵列检测器联用仪(HPLC—DAD)等已基本普及，液相色谱与质谱联用仪(LC—MS)也开始进入实验室。就笔者近十几年对此类仪器使用的经验和研究结果可知，如采用这样既具有色谱分离特性又具有光谱定性特性联用仪器来进行中药色谱指纹图谱测定的话，借助近年来发展的化学计量学技术和已有的光谱波谱标准库，是完全可能对大部分中药的化学成分进行定性和相对定量分析。如更进一步，将这样可知大部分化学成分的中药指纹图谱与药效结果相对应起来，继而采用可进行多变量解析的化学计量学方法，将中药色谱指纹图谱中化学成分的变化和中药药效结果从数量上联系起来，建立起有实际意义的中药“谱效”学，必将对我国中医药现代化起到非常重要的促进作用。笔者希望我国一批有作为的中药企业能及时抓住这一可持续发展的机遇，借国家药品监督管理局决心采用中药色谱指纹图谱对我国中药进行全面质控的东风，为在我国中药产业建立起有中国人自己知识产权的中药高水平全面质控的标准，为早日实现我国的中药现代化作出贡献。
4  中药色谱指纹图谱评价的可操作性探讨
    由于中药色谱指纹图谱给出的是非常复杂的有机物混合体系中各种不同化学成分浓度分布的整体状况，它明显地是一个多指标多变量体系，采用已提出的测共有峰和非共有峰质量标准体系来进行计算，应不失为一个可行方法。可是，我们在实际操作中也发现了几个困难：1．定一个统一的共有峰和非共有峰比例是否可对任一中药都适用?此比例似难以固定(参见图1)。对于中药成品，还可通过对工艺的改造或在投料生产前进行“勾兑”使其统一，但应用于复方制剂时情况要复杂的多。2．对有背景漂移或严重重叠的多峰的指纹图谱，如本文给出几个例子，仅峰数目或峰面积积分的计算如采用手工进行，就不是一个小工作量c而且，实际操作时还有一些意想不到的困难。更为重要的是，有没有此必要．如何定义小色谱峰与噪声峰的区别?等等。这些具体的技术上的疑点和难点，将给政府药检部门签发检验报告书带来不少困难。问题是，这样做对指纹图谱的质控到底有无必要?根据所得的中药色谱指纹图谱，一眼即可区别它们是否来自同种药材，我们还有必要死盯住一些细微末节吗?然而，要作为可执行的检验报告书和质量控制法规，没有一个统一旦可量化的标准计算和评价方法，我们似乎又寸步难行。
    如跳出这一维谷，再根据前述的中药色谱指纹图谱的定义，把中药色谱指纹图谱看成是一种综合的、可量化的色谱鉴定手段，并记住其基本届性在于其”整体性”和“模糊性”，似乎又可进入另一境界。比如，我们有没有可能藉多元统计方法，建立起一个直观可视、合理而又简便、精确而又包容模糊且操作方便的中药色谱指纹图谱的计算机统一处理方法呢?从现代数学和计算机发展的水平来看，这是完全可能的。毕开顺和苏薇薇等就曾用化学模式识别方法对此进行过有益探讨。中药色谱指纹图谱形象地反映了药用植物物种的具有遗传特性的次生代谢的“共有特征”，可又由于只是次生代谢，它将必然受到地域和生长环境等多种不定因素的影响，应具有统计学中多元随机分布的“模糊性”。据笔者多年从事化学计量学研究的经验，建立一种可同时反映此两种特征的方法，将不会是很困难的。

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