神马文学网蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化(1)
来源：百度文库 编辑：神马文学网 时间：2024/04/30 20:04:49
蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化(2)
Update:2008-07-22From:ibioo.Com Hot:670 将蛋白质从凝胶转移到膜蛋白质从凝胶转移到膜上的过程中同时保持它们的相对位置和分辨率，这被称为印迹。印迹可以以三种不同的方式实现：
简单扩散：将膜放在凝胶上，同时放一沓干滤纸在膜上，并在滤纸上放置重物以加快扩散过程。这种方法可用于将蛋白质从一块凝胶上转移到多个膜上，同一凝胶可得到几个印迹膜。扩散法的主要缺点是不能定量转移，与电转比较只能转移25-50%的蛋白质。
真空辅助溶剂流动：用泵的吸力将分离的蛋白质从凝胶转移到膜上，高低分子量的蛋白质都可以用这种方法转移；然而，分子量小于14KD的蛋白质需要用较小孔径的膜（0.2um），因为它们不易被0.45um膜吸附。很少从聚丙烯酰胺凝胶中真空转印蛋白质，而从琼脂糖中转移核酸则常用此法。
电洗脱或电转移：最常用的转移方法，与扩散或真空印迹相比，其主要优点是速度和转移更完全。
电转移方法
两种常用的电转移方法是湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。
湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。另外用这种方法转移2-D电泳中常规使用的大胶比较困难。湿转系统一般在恒压条件下进行，转移过程中混合缓冲液保持电流相对恒定。
半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法又快（15-45分钟）又好。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而，半干印迹系统因缓冲液较少不适于较长时间转移。对于大2-D胶的印迹，半干转移是理想选择。半干印迹仪一般使用恒流条件，转移过程中电压逐渐增加。半干转移系统中，滤纸和膜切成和凝胶相同大小，这样电流必须通过凝胶，否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间
的任何地方存在气泡。气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。
转移缓冲液
转移缓冲液提供电极之间的电连接，必须能够导电。同时它也提供一种化学环境保证蛋白溶解，而不需担心蛋白质在转移过程中不能吸附到膜上。常规配方可满足多数蛋白样品的需要。多数缓冲液在转移过程中产生热量。针对此原因，很多湿转装置配备嵌入式冷却线圈。湿转也可在冷室中进行，缓冲液使用前可预冷。半干转移中电极板起到散热器功能。但它们的散热能力有限，一般半干转移不能进行太长时间。
传统转移缓冲液由缓冲系统和甲醇组成。Towbin缓冲液，一种Tris-甘氨酸缓冲液，常用于湿转系统。该缓冲液PH为8.3，比大多数蛋白质的等电点（pI）要高。蛋白质带净负电荷并向阳极迁移。因为缓冲液在槽中混合，转移过程中离子分布相对稳定。
半干系统使用三缓冲液系统。使用三种缓冲液是因为转移是等速电泳过程，蛋白质在前导离子和尾随离子之间迁移。三种缓冲液是：
阳极缓冲液Ⅰ：0.3M Tris, PH 10.4
阳极缓冲液Ⅱ：25mM Tris, PH 10.4
阴极缓冲液：25mM Tris, 40mM ε-氨基乙酸，PH 9.4
阳极缓冲液Ⅰ中和阳极板表面产生的过量质子。阳极缓冲液Ⅱ含与阳极缓冲液Ⅰ相同的PH,但Tris浓度降低到25mM。阴极缓冲液含ε-氨基乙酸，转移过程中作为尾随离子，随着蛋白穿透凝胶迁移到阳极不断被消耗掉。
通常不推荐用单缓冲液代替三缓冲液系统。单缓冲系统中整个凝胶转移有不一致的趋势，且经常转移不彻底。
尽管上述缓冲液系统适用于大多数蛋白转移，文献中还有很多适于不同应用的变化类型。最明显的变化之一是推荐10mM CAPS缓冲液（PH 11）用于蛋白质测序。在使用Edman化学法进行自动蛋白质测序时，Towbin缓冲液以及凝胶电泳缓冲液中的甘氨酸会引起高背景。改变缓冲液成分可以显著降低这种影响。对缓冲强度和组成的任何修饰都应非常注意，确保转移装置不会过热。