Western Blot 操作原理步骤

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基本原理 【动画】
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基本原理（点击播放）
免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。
典型的印迹实验包括三个步骤：
①蛋白质的电泳分离
②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域
③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。

免疫印迹法原理示意图
第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。
本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。
样本的制备
几乎任何蛋白质都可用于免疫印迹。免疫印迹的优势是能分析不能用其他的免疫化学技术进行研究的蛋白质样品。例如，不能标记的蛋白质或不溶于温和抽提缓冲液的蛋白质等。免疫印迹还可分析各种组织、器官或微生物等来源的粗制样品。
用于免疫印迹的样本种类繁多，处理的方法也有所不同，为了选择理想的处理方法，应当考虑细胞的类型和待测抗原的性质。
细菌表达蛋白质和样本制备
一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解，具体方法如下：
[试剂与设备]
（1）表达待检测蛋白质的细菌。
（2）50mmoL／LTris-HCl（pH7.4）。
（3）2xSDS凝胶加样缓冲液：
100mmol／L Tris—HCl（pH6.8）
200mmol／L 二硫苏糖醇（DTT）
4％ SDS（电泳级）
0.2％ 溴酚蓝
20％ 甘油
不含有二硫苏糖醇（DTT）的2XSDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前须从1mol／L二硫苏糖醇储存液现用现加于上述缓冲液中。
（4）台式离心机。
（5）超声破碎仪。
（6）水浴箱。
（7）涡漩振荡器。
（8）加样器与吸头等。
[操作步骤]
（1）表达靶蛋白大肠杆菌经诱导适当时间后，用微量离心机以12 000g离心30s，收集1ml培养的菌体。
（2）吸取培养液，加入0.5ml用冰预冷的50mmol／LTris—HCl（pH7.4），振荡沉淀的菌体，
使之复悬，用微量离心机于0°C以12000g离心30s回收菌体。
（3）再次吸出上清液，小心地吸净管壁上的液滴，尽可能使沉淀物不带有残留液体。
（4）加入25μl水，振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来，立即加入25μl 2XSDS凝胶加样缓冲液，继续振荡20s。
（5）样品在沸水浴中放置5min。
（6）采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对DNA进行剪切，根据所用超声处理仪的输出功率及其设定状态，以最大功率处理0.5—2min应能有效地将裂解液粘度降至可控水平；
（7）样品于室温以12000g离心10min，将上清液移至另一管中，弃沉淀物；
（8）吸取经剪切或超声处理的样品25μl电泳，剩余样品保存于—20~C备用。
快速裂解酵母细胞制备样本
使用这种方法会使蛋白质变性，在所用抗体能识别变性靶蛋白时才能使用这一方法。
[试剂与设备]
（1）待检测的酵母菌。
（2）25％三氯乙酸（TCA）
（3）1％SDS。
（4）丙酮。
（5）RIPA缓冲液：
50mmol／L Tris—HCl（pH7.5）
150mmol／L NaCl
1％ Nonidet P-40 （NP-40）
0.5％ 去氧胆酸钠
0.1％ SDS
（6）玻璃珠（直径0.45—0.50mm）。
（7）台式离心机。
（8）水浴箱。
（9）涡漩振荡器。
（10）加样器与吸头等。
[操作步骤]
（1）0°C以12000g离心lmin，从lml培养物中收集细胞，弃上清液（当靶细胞为分泌型蛋白时除外）。
（2）用0．5ml 25％三氯乙酸（TCA）重悬细胞。
（3）按步骤1离心回收细胞，重悬于1ml 90％丙酮中。
（4）按步骤（1）离心，估算沉淀物体积，加入等体积1％SDS重新悬浮沉淀物。
（5）加入经酸处理的玻璃珠（直径0．45—0．50mm）至溶液的弯月面处。
（6）振荡悬液5次，每次间歇期间将悬液置于冰浴中冷却lmin，在相差显微镜下监测细胞
（7）用一烧红的皮下注射器针头（23号）在微量离心管的顶盖上穿一小洞，以防加热过程中玻璃球冲出离心管。
（8）在沸水浴中加热3min。
（9）把玻璃珠转移到另一个微量离心管中，用0.5ml RIPA缓冲液洗涤原离心管，并把洗液合并于内装玻璃珠的管中。
（10）在微量离心管底部打一小洞，回收细胞提取液，这一操作使用烧红的皮下注射器针头效果最佳。把仍装载玻璃球的微量离心管置于另一空微量离心管上，把如此重叠的一对微量离心管，于4°C以2000g离心2min。
（11）回收下面一只内有细胞提取液的微量离心管，于4°C12以2000g离心5min，使提取液澄清，移出上清液置于另一个微量离心管中，—20°C贮存备用。
[注意事项]
酵母细胞提取液储存于—20°C一般是稳定的，但是，如果待测蛋白被水解，则应在提取液中加入蛋白酶抑制剂，并保存于0°C。
哺乳动物细胞和组织的样本制备 【动画】
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哺乳动物细胞和组织的样本制备（点击播放）
哺乳动物细胞和组织有单层培养细胞、悬浮培养细胞和组织碎片，虽然均可采用凝胶加样缓冲液裂解的方法来制备样本，但制备方法有所差异。
这里介绍其中两种方法：①对单层细胞的处理方法 ②对悬浮培养细胞和组织碎片的处理方法
对单层细胞的处理方法
[试剂与设备]
（1）磷酸缓冲盐溶液（PBS）。
（2）1XSDS凝胶加样缓冲液（参见“细菌表达蛋白质和样本制备”）。
（3）水浴箱。
（4）吸管、细胞刮棒等。
[操作步骤]
（1）用磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗细胞2次，弃去洗液并吸净残余的PBS液体。
（2）如直径为90mm的平皿，则加人100-200μl加热到85°C的1XSDS凝胶加样缓冲液溶解细胞，用细胞刮棒把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中。
对悬浮培养细胞和组织碎片的处理方法
[试剂与设备]
（1）悬浮缓冲液的配制：
0.1mol／L NaCl
0.01mol／L Tris—IICI（pH7.6）
0.001mol／L EDTA（pH 8.0）
1μl／ml Aprotinin
100μg／ml 苯甲基磺酰氟（PMSF）
（2）2XSDS凝胶加样缓冲液（参见“细菌表达蛋白质和样本制备”）。
（3）台式离心机。
（4）吸管或真空抽吸装置。
（5）加样器和吸头等。
[操作步骤]
（1）取1s组织或109细胞，加lml冰预冷的悬浮缓冲液分散细胞或组织碎片（把细胞悬浮于上述缓冲液是为了防止加入2XSDS凝胶加样缓冲液时形成不溶性团块，这一步应使用冰预冷的悬浮缓冲液而且操作应尽可能迅速，以减少蛋白质降解。大多数哺乳动物组织可以在悬浮缓冲液液面之下迅速用镊子分开或用剪刀剪碎。）
（2）于4℃以3000g离心5min，估算离心管底部沉淀物的体积。
（3）吸出上清液，用连接于抽真空装置的一次性使用吸头把管壁上的液滴吸净。
（4）尽快加入等体积的2XSDS凝胶加样缓冲液。
[注意事项]
PMSF 严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸人、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之，凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF在水溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20μmol／L的PMSF水溶液的半寿期大约为35min，PMSF通常配成10mmol／L或100mmoL／L浓度的贮存液（1.74或17.4mg／ml溶于异丙醇中）保存于-20℃。
免疫沉淀蛋白的样本制备
一般情况下，粗提样品无需进一步纯化即可直接进行凝胶电泳。但下述两种情况在免疫印迹之前，使用免疫沉淀制备蛋白的效果较好。一是含量极稀少蛋白的检测，由于适合凝胶电泳分辨的蛋白质总量有一定限度，通常不可能在凝胶中加入足够量的蛋白质样品来检测含量极稀少的抗原，此时可采用标准的免疫沉淀技术纯化和浓缩待测蛋白；二是免疫沉淀可用来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，此时，用于免疫沉淀的抗体和免疫印迹的抗体分别针对复合物中的不同蛋白质，如果清楚该复合物的性质，并知道应该使用何种抗体时，这种方法就非常有用，为研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用提供了一种有效的方法。
[试剂与设备]
（1）样品缓冲液。
Tris／Glyeine SDS—PAGE样品缓冲液是：2％SDS，100mmol／L DTT（取自—20°C存放的lmoL／L贮存液，临用前加入），60mmol／L Tris（pH6.8），0.01％溴酚蓝和10％甘油。
（2）水浴箱。
（3）加样器和吸头等。
[操作步骤]
（1）将样品缓冲液加人吸附有抗原和抗体，并经过洗涤的A蛋白或C蛋白微珠中。使样品缓冲液和微珠的体积比率至少为2：1—5：1左右更好，但一般不超过10：1.
（2）样品置70°C水浴加热至少5min。除特殊情况外，在凝胶内加样之前不必去除微珠。
（3）样品既可立即使用也可冻存。—20°C存放的样品可稳定保存数月。
[注意事项]
（1）对照设置：实验对照的设置应包括能与免疫抗体共沉淀的样品和能与非免疫抗体共沉淀的样品。通过两者比较可以鉴别抗体所形成的特异性条带和非特异性条带（例如，来自于重链的条带）。此外还应该包括含有已知的或标准量的待测抗原的阳性样品，阳性对照可以是含有已知或标准量待测抗原的任何样品，来源于细菌或杆状病毒超常表达系统或来源于已充分鉴定的细胞系。该样品不必经过免疫沉淀但应在临近的胶道和其他样品同时上样电泳。这样能够提示免疫印迹是否成功，并对抗原的相对分子量进行精确比较。如果阳性对照中抗原的量是已知的，可粗略估计待测样品中抗原的含量。
（2）常见问题与解决方法：有一个值得注意的问题，将免疫沉淀制备的蛋白用于免疫印迹时，来自免疫沉淀的抗体会出现在印迹膜上。该抗体可被二抗试剂检出。通常抗体重链和轻链的大小并不干扰待测抗原的鉴定。然而，若待测抗原的大小在50kD或25kD左右（大约为重链和轻链多肽的大小），则难以对待测抗原进行鉴定。出现这种情况，有两种解决办法：一是可将免疫沉淀抗体共价结合在A蛋白或C蛋白微珠上；其二是采用直接检测技术进行测定。
蛋白质凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。SDS-PAGE是最常用的凝胶电泳技术。它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板，见图2.SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。

图2 SDS-PAGE凝胶分层示意图
待分离蛋白质样品在电泳中的泳动速度，或相对迁移率（Mr）与蛋白质本身性质（如分子大小）、凝胶孔径和电泳条件（如电流、电压）等密切相关，蛋白质结合大量的SDS后，各组分之间的的形状和电荷差异被抵消，此时蛋白质在电场中泳动速度的快慢，仅与各自分子量的大小有关。因此，可根据下列公式计算分子量大小:
lgMW=lgK—bMr
其中，MW为蛋白质的分子量，K为常数，Mr为相对迁移率，b为斜率。将已知分子量的几种标准蛋白质在电泳中的相对迁移率对其分子量的对数做图，即可得到一条蛋白质分子量校正曲线。根据待测样品的相对迁移率，可由校正曲线查到其分子量大小，蛋白质样品中加SDS煮沸后，蛋白质发生变性，为保护和还原二硫键，尚需加还原剂2-巯基乙醇（2-ME）或二硫苏糖醇（DTT）。蛋白质变性使亚基聚合形式存在的蛋白质解聚成单个亚基。因此，对于一个纯化蛋白质，可经SDS-PAGE确定其亚基种类、数目及大小。上述蛋白质分子量测定更确切地说是蛋白质分子各亚基分子量的大小。
丙烯酰胺凝胶孔径对电泳速度及分离效果影响很大。凝胶孔径的大小取决于丙烯酰胺（Aery）单体及N，N—亚甲基双丙烯酰胺（Bis）的含量及比例。总胶浓度（T）可在3％～30％范围内变动，T为8％～15％的凝胶，适用于大多数蛋白质样品的分离。交联度（C）是反映凝胶聚合情况的一个指标。凝胶聚合过程中，Acry单体之间形成延伸的多聚链，并通过Bis的作用，连接和交叉成网状结构，最终成为肉眼可见的凝胶。催化剂过硫酸铵（APS）和加速剂四甲基己二胺（TEMED）直接影响凝胶聚合质量。二者加量过多，会使Acry单体聚合链较短，聚合不充分，胶的脆性增加；反之，如加量过少，则聚合速度大大降低，甚至只出现所配制的胶溶液黏度稍增加、无胶状物出现的现象。见图3.

图3 相对迁移率与分子量对数关系简图
根据电泳的目的和要求及样品的特点，可采取恒流或恒压条件进行电泳。
由于印迹技术需将蛋白质成功地从胶中转移至膜上，因此，选择合适的凝胶甚为重要。一般情况下，丙烯酰胺和交联剂的比例越低，转移就越易进行。超薄胶转移的速度快，而且彻底。通常，应根据目的选择厚度、大小均适合的凝胶。若想寻求蛋白质的最佳分辨力，长胶的效果较好，使较大分子量的蛋白质更好地分离。若想达到最大的灵敏度，胶的厚度可增加到1.5mm，并且在不发生变形的前提下，尽量提高蛋白的上样量。若主要考虑的是分离速度，则选用微型胶，厚度为0.5mm。表1显示SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围。
表1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围

试剂与器材
（1）Acry／Bis贮存液：29.2gAcry，0.8gBis，加60m1双蒸水充分溶解后，再加双蒸水至100ml。过滤后，于4℃避光保存。
（2）分离胶缓冲液：1.5mol／L Tris-HCl，pH8.8：18.15g Tris，溶于60ml双蒸水中，用1mol/L HCl调pH至8.8，加双蒸水至100ml，于4℃保存。
（3）成层胶缓冲液：0.5mol／L Tris-HCl，pH6.8：6.0g Tris，溶于60ml双蒸水中，用 1mol／LHCl调pH至6.8，加双蒸水至100ml，于4℃保存。
（4）10％APS：1.0g APS加10ml双蒸水溶解，一20℃分装冻存，或新鲜配制。
（5）TEMED：原液。
（6）10％SDS：10g SDS溶于80m1双蒸水中，加热搅拌至完全溶解，定容至100ml。室温保存。
（7）50％甘油：50ml甘油加50ml双蒸水，配成100ml溶液。
（8）样品缓冲液（6X）：成层胶缓冲液1.Oml，50％甘油0.8ml，10％SDS 1.6ml，2-ME0.4ml，0.05％溴酚蓝0.2ml，双蒸水4.0ml。混合均匀后，分装冻存。
（9）电极缓冲液（1X）：pH8.3：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，1.0g SDS，加双蒸水至1000ml。
（10）蛋白质分子量标准晶：蛋白质分子量标准（高分子量和低分子量）均有商品供应。
（11）垂直板电泳装置：电泳槽（JM—250型，大连）。
（12）电泳仪。
（13）玻璃微量进样器：加样枪配扁而长的加样头亦可。
操作步骤 【动画】
（1）将两块玻璃扳组成的灌胶模具（其中一块上口带有凹槽，另一块内面两侧粘有凝胶板隔离胶条，胶条厚度为0.5mm、0.75mm、1.0mm，按所需凝胶厚度选择）洗净、晾干，按图4安装好。

图4 灌胶模具安装示意图
（2）选择合适的分离胶浓度，按表2配制所需分离胶溶液。
表2 分离胶溶液配方

（3）将分离胶液混合后缓慢倒入玻璃板之间，并即刻在胶表面用滴管沿凝胶板内壁滴加2～3mm高的水饱和正丁醇（无水乙醇亦可），以防止空气中的氧扩散进入胶液，影响聚合（胶液与正丁醇分界面可见清晰的折光线）。
（4）待分离胶聚合后（约30～40分钟），倾去表面液体，用少量分离胶缓冲液洗2～3次，多余的液体用滤纸条吸干。
（5）配制成层胶缓冲液：3.05ml双蒸水，0.65ml Acry／Bis液，1.25ml成层胶缓冲液，50μl 10％SDS 50μl 10％APS，5μl TEMED。总体积5.0ml，T为4％。
（6）将成层胶液混合后，缓慢加到分离胶表面，至凹口玻璃板上缘。小心插入梳子（梳子应在步骤1安装完毕后，预先试一下是否合适），注意排除气泡。
（7）30分钟至1小时后，小心拔出梳子，去掉四周封闭乳胶管，将凝胶板与上、下电泳槽连接好。
（8）上层电泳槽中加电极缓冲液没过加样孔，并用电极缓冲液冲洗加样孔。如个别孔发生扭曲，可将玻璃微量进样器针头插入孔中，把孔间的短胶柱推正。
（9）待测蛋白质溶液中按1：4比例加样品缓冲液，如为沉淀及冻干粉，样品缓冲液应稀释4～5倍后加入，并使样品充分溶解。蛋白质分子量标准按商品说明书处理。沸水浴中煮3～5分钟后上样。
（10）恒压电泳。样品在成层胶中泳动时，电压为100V，进入分离胶后，电压增至150～200V（约15V／em）。为防止电泳产热过多，应外接冷却水装置。
（11）当样品缓冲液中的溴酚蓝指示剂移至凝胶底部时，终止电泳（约3小时左右）。取出凝胶板，小心将两板之间的胶移至较大的表面皿中。此凝胶可直接进行染色观察；亦可进一步通过免疫印迹技术，对待测蛋白质进行检测。
注意事项
（1）分离胶中加入少量甘油可增加胶的柔韧性，使胶不易破裂。
（2）配制胶液时，最后加APS和TEMED，加入后即刻使胶液充分混合，但要防止剧烈摇晃而产生气泡。
（3）表中所加试剂的量是依据灌制面积为14cm×l4cm，厚度为1mm的凝胶而设定，其他规格的凝胶板试剂用量可参考此表，进行适当调整。
（4）Acry、Bis具有神经毒性，实验中应带手套操作。
（5）可选用恒流条件进行电泳，如：样品在成层胶中泳动时，电流为30mA，进入分离胶后，电流增加至40mA；亦可以4～5mA低电流，电泳过夜，次日增加电流至10～12mA 5～10分钟，以改善样品的少量扩散。
（6）待分离样品的质、量直接影响电泳效果，如：若电泳出现波浪线，则说明上样量过多，应减少上样量；若样品中含盐浓度过高，应先透析，以便除掉盐分；若样品黏度过大（如细胞蛋白质），最好先用超声波破碎染色体DNA后再电泳。
（7）如果待分离样品中蛋白质组分分子量的变化幅度大，则应考虑用梯度发生器制备5％～20％的梯度胶，以达到满意的分离效果。
基本原理 【动画】
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将蛋白质从凝胶中转印致膜上（点击播放）
电泳后蛋白质样品转移的方法，包括半干式转移、湿式转移等。各种转移方法原理相似，都是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成"Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极（连接方式如图5所示）。

图5 转移单位示意图
可用于免疫印迹的固相载体有多种，硝酸纤维素膜、尼龙膜、带正电荷的尼龙膜及PVDF（聚亚乙烯双氧化物）膜。硝酸纤维素膜最为常用，具有结合能力强，膜不需要活化，背景浅，能进行多次免疫检测并可用常规染色方法，功能基团寿命长等优点，但极易破碎不易操作。尼龙膜软且结实，较硝酸纤维素膜易操作，具有与蛋白质或蛋白质-去污剂混合物有很高的结合力，每平方厘米可结合480pg蛋白（而硝酸纤维素膜只能结合80Pg），因此灵敏度高，背景也高，因为其高电荷密度使对其非结合区进行封闭较为困难。带正电荷的尼龙膜能有效地结合低浓度的小分子蛋白，酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖，当转印液中有SDS时，蛋白质容易从膜上泄漏，用甲醇固定能提高蛋白质在尼龙膜上的保留指数。PVDF膜在制备多肽供蛋白质化学分析中最为常用。在进行蛋白水解和序列分析时，通常是先将蛋白质结合在PVDF膜上。
将凝胶中的蛋白质转印至膜上的方法很多。目前常用方法是电洗脱或电印迹。其主要优点是转印迅速、完全。电洗脱有两种方法：一种是湿转印法，即将凝胶-膜夹层组合完全浸入转印缓冲液中；另一种是半干转印法，即将凝胶-膜夹层组合放在浸有转印缓冲液的吸水纸之间。前者是将夹层组合放人有铂丝电极的缓冲液槽中。而后者是将凝胶-膜夹层组合置于两个石墨平板电极之间。这两种转印的装置效果均较好，可根据实验室条件来选择。
试剂与器材
（1）电泳凝胶。
（2）转移缓冲液：pH8.1—8.4：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，200ml甲醇充分溶解后，加双蒸水定容至1000ml。
（3）TBS缓冲液：1.21g Tris，8.77gNaCl，加HCl调pH至7.4，加水定容至1000ml。
（4）TTBS缓冲液：在TBS中加入Tween—20，浓度为0.1％，4℃保存1个月。
（5）封闭液：1.5g脱脂奶粉溶于50ml TTBS中，现用现配（用1％～3％的BSA，或10％胎牛血清亦可）。
（6）特异单克隆抗体：用封闭液适当稀释。
（7）酶标第二抗体：辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）标记。
（8）蛋白质转印膜：NC（硝酸纤维素）膜、PVDF（聚偏二氟乙烯）膜，或尼龙膜等均可。
（9）显色底物。
（10）恒温振荡器。
（11）半干式电泳凝胶转移仪。
（12）Whatman 3mm滤纸。
（13）手套。
（14）孵育及显色用塑料盒。
（15）塑料袋。
（16）塑料封口机
操作步骤（半干式转移）
1.转移
（1）电泳后的凝胶先切除成层胶及需要进行凝胶直接染色的孔道部分，并将胶剪一小角作为定位标记，然后放在转移缓冲液中平衡30分钟左右。
（2）将转印膜1张及6张Whatman滤纸剪成与胶同样大小。转印膜用前需在转移缓冲液中平衡10～15分钟，滤纸用前在转移缓冲液中浸湿即可。
（3）由下至上将3层滤纸、膜、凝胶及3层滤纸依次放好。每放一层都应注意排除气泡。如有气泡，可用光滑的玻璃棒或试管在各表面缓慢滚动，予以排除。
（4）将转移装置连接好，接通电源。恒流下转移，0.8mA／cm2，转移30分钟至1小时。
（5）关闭电源，取出膜，然后用双蒸水漂洗l～2分钟，放在滤纸中干燥备用。注意膜上要做好标记。
2．检测
（1）将膜放在塑料盒中，加入适量封闭液，于37℃恒温振荡器上放置1小时，或4℃过夜。
（2）将膜转入塑料袋中，加入用封闭液稀释的第一抗体，于37℃或室温孵育反应1小时。
（3）剪开塑料袋，倾去第一抗体液体，用镊子将膜移至塑料盒中，加TBS洗3次，每次15分钟。
（4）加入稀释好的酶标第二抗体，继续在37℃或室温孵育反应30分钟至1小时。
（5）同步骤（3），洗膜。
（6）加底物显色液。此步骤一般要求避光进行。最好即时检查一下，以控制显色程度，防止本底过高及出现非特异条带。
（7）终止反应，用双蒸水大量冲洗，然后将膜放于双层滤纸中干燥保存。
注意事项
（1）如采用PVDF膜，使用前应在甲醇中浸泡一下，再移至转移缓冲液中平衡。另外，PVDF膜在检测时，采用TTBS缓冲液。
（2）电泳凝胶一般可重复转移1次，以获得两张相同的膜，第2次转移的时间可略延长。
（3）如待分析的蛋白质分子量大，转移时间也需延长。
（4）上述显色检测方法仅给出了基本步骤，采用不同检测系统，需按厂家说明书具体操作。
（5）电泳转移操作时，保证滤纸、膜、凝胶其间无气泡存在是实验的关键步骤。因即或有微小的气泡残留，电泳时局部温度升高，气泡膨胀会严重影响印迹结果。
转印后切取印迹膜
有时转印后需将印迹剪成较小的片状进行单独处理。单个泳道可以泳动同一样品，待彼此分开后，可用不同的抗体并列检测。如以电泳方向剪膜，就可在同一样品中检测不同分子大小的抗原。为了简便而精确地找到泳道，电泳之后用丽春红S（Ponceaus S）或印度墨汁对印迹膜进行染色，便可很快确定待测蛋白质的位置并将其剪下。表3表明两种染料的适用范围及优缺点，用丽春红S染色的优点是操作简便，价廉和具有可逆性，在封闭过程中，染色易消褪，且不干扰进一步的检测。
在某些情况下，可能想用印迹中的较高分子量区域来检测一种抗原，用另一个区域来检测另一不同分子量的蛋白质。为了使印迹中不同的区域正好对应于相应分子量的范围，这需要在对照泳道中加入已知分子量的蛋白质。这样可方便地在印迹中找到适当的区域并将其剪下。
使用预染的分子量标记，可为转印后切下所需印迹提供良好的指示，此类标记已商品化，但是比丽春红S染色法昂贵。标记中的颜色除了增加成本对实验并无不良影响，而且在泳动时非常漂亮。
表3 用于免疫印迹染色的染料

印迹膜蛋白染色
[所需试剂]
（1）2％丽春红S浓贮存液（3-羟基-4-[2-磺基-4-硫代-苯偶氮基]-2，7—萘二磺酸）：溶于30％三氯醋酸和30％磺基水杨酸中。贮存液可在室温下稳定存放1年以上。
（2）PBS。
[操作步骤]
（1）在染色之前，先配制丽春红S的应用液。即将2％的丽春红S浓贮存液用1％醋酸1:10稀释即成为应用液（注意：如果使用硝酸纤维膜，须将丽春红S应用液更换为用水1:10稀释）。
（2）用丽春红S应用液将PVDF膜洗1次。
（3）加入新鲜稀释的丽春红S应用液，并在室温下搅动5～lOmin。
（4）将PVDF膜放人PBS中漂洗数次，每次1～2min，并更换PBS。
（5）根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记，至此PVDF膜可用于封闭和加入抗体。
免疫检测主要取决于抗原抗体的特异性，特别是能够识别膜上变性的和固定化抗原的抗体。因印迹膜上有非特异性吸附蛋白质的位点，因此需进行封闭以防免疫试剂的非特异性吸附。将印迹膜与一定浓度的不参与特异性反应蛋白质或去污剂溶液孵育可实现封闭。然后通过抗体与膜上抗原的特异性结合来定位抗原。抗原可用易观察的标记的抗体进行检测。抗体本身可以标记，直接用于检测抗原，但更为常见的是，使用的抗体是非标记的，而用标记的二抗采进行抗原定位。
常用的标记方法有酶联法，一般是用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，具体的介绍见本书第四章“免疫标记技术”。近年来，化学发光（CL）法已成为常用的方法之一。该法是基于环化二脂酰肼（cyclic diocyhydrazide）的化学氧化作用，生成一种不稳定的中间产物，当其衰变时即可发光。发出的光可使标准X-光片感光，产生较易识别的图像。化学发光法比过去使用的显色或放射活性检测法更加灵敏。尽管对灵敏度增加的幅度还有很多争论，但一般认为比显色法大约增加20倍，比放射活性检测方法约增高 7倍。该法的关键是使用了辣根过氧化物酶偶联物作为二抗或二级试剂。辣根过氧化物酶可与抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白C或其他可与一抗特异结合的试剂共价结合。在过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶催化鲁米诺（氨基苯二酰一肼）氧化后即可发光。
除了蛋白质样品的电泳分离过程之外，在进行免疫印迹操作之前，还考虑下面两个问题。
印迹膜上非特异性蛋白质结合位点的封闭
表4 总结了常用的封闭液及其优缺点。尽管这些封闭液在某些情况下使用较为满意，但是仍需要仔细选择以确保其能适合于检测试剂。几乎适合于所有检测系统的两种封闭缓冲液是脱脂奶粉和牛血清白蛋白。若蛋白质封闭液造成本底过高或干扰检测，则可试用吐温20封闭液。
表4 常用的封闭液

*若不愿每次新鲜配制封闭缓冲液，应加入0.01%硫柳汞制剂作为防腐剂。避免使用叠氮化钠，因其能抑制辣根过氧化物酶的活性。
直接与间接检测方法
直接法是指用标记的第一抗体（一抗）来进行检测的方法，用这种类型的抗体对膜上抗原进行免疫检测的本底较低，并且在同一张印迹膜上可同时使用来源或特异性不同的多种抗体，但灵敏度不如间接法。间接检测是指先使用非标记的一抗，然后用可与一抗结合的标记第二抗体（二抗）进行检测的方法。由于二抗分子是多价的，具有放大效应，因而灵敏度较高。因此，除非需要直接检测抗原的特异性，否则最好是选择间接法进行免疫印迹测定。通常选用与辣根过氧化物酶偶联的抗免疫球蛋白抗体商品试剂来检测一抗，分别针对不同种属来源的一抗。这样，一个实验室只需备用针对小鼠，大鼠，家兔和其他一抗的少数几种通用试剂即可满足各种免疫印迹实验要求。
下面以间接检测法为例介绍免疫检测的方法。
间接检测法
[准备工作]
在准备做抗原检测时，须考虑所用一抗和二抗的最佳浓度，对不同来源的抗体，其特异性林的浓度都不相同。因此，对一抗体进行滴定有助于确定最佳反应比例，预先滴定二抗对实也有帮助，一旦确定最佳浓度，则每次印迹即可用同一批一抗、二抗来完成。多数情况下可用商家提供的浓度进行检测。
[材料与试剂]
（1）PBS：称取8g NaCl；0.2gKCl；1.44g Na2HP04和0.24g KH2PO4，加蒸馏水800ml，用HCl调节溶液pH值至7.4，加水至1L，在1.034X105Pa高压下蒸气灭菌20min，室温保存。
（2）封闭液（见表4）。
（3）1%BSA/PBS。
（4）一抗试剂和碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的二抗试剂（通常是用辣根过氧化物酶标记的抗免疫球蛋白抗体）。
（5）碱性磷酸酶底物溶液:
1）NBT（氮蓝四唑）溶液:在10ml 70%的而甲基酰胺中溶解0.5gNBT。
2）BCIP（5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸）溶液:在10ml 70%的而甲基酰胺中溶解0.5g BCIP。
3）碱性磷酸酶缓冲液：100mmol／LNaCl；5mmol／L MgCl2；100mmol／L Tris-HCl（pH9.5），置密闭容器中保存，此溶液稳定。
4）取66rdNBT溶液与10ml碱性磷酸酶缓冲液混匀，加入33plBCIP溶液。
5）辣根过氧化物酶底物溶液：用9ml的0.01mol／L Tris-Cl（pH7.6）溶液中溶解6mg 3—3，—二氨基联苯胺，加入lml 0.3％（w／v）NiCl2或CoCl2，用Whatmanl号滤纸过滤以除去沉淀，加入10yB0％H202混匀后立即使用。此溶液须在临用时配制。
[操作方法]
（1）用PBS漂洗印迹膜数次。
（2）加入一种封闭液（见表4）。注意：不同的抗原和实验方法需用不同的封闭缓冲液。例如，BSA（V部分）和牛奶都含有磷酸化的酪氨酸和生物素，用特异性抗磷酸化酪氨酸抗体进行实验时，这会给解释实验结果造成一定的混淆，也给亲合素／链霉亲合素检测的应用带来一些问题。某些牛奶制品可抑制碱性磷酸酶的活性。若无信号或检测背景较高，则需尝试不同的封闭缓冲液。
（3）室温下搅动孵育。一般孵育20min～2h或4℃过夜较好。
（4）从封闭缓冲液中取出印迹膜，用PBS漂洗3次，每次5min。
（5）加入工作浓度的一抗溶液。每张15X15cm的印迹膜用量为10ml。所有的稀释液均用含有蛋白质的溶液，例如1％BSA／PBS。孵育可在浅盘或塑料袋中进行。在室温下将抗体和印迹膜搅动孵育至少1h。有人认为4℃孵育过夜（12～18h）可提高灵敏度。
（6）用PBS漂洗印迹膜4次，每次换液洗5min。 ，
（7）此时，印迹膜便可加人工作浓度的标记的二抗溶液。可在浅盘或塑料袋中室温孵育1h。抗体用含有蛋白质的溶液进行稀释，例如 1％BSA／PBS。商品化的酶标二抗应在0.5～5μl／ml浓度之间使用（通常将商品试剂原液稀释成1：200～1:2000的应用液）。用辣根过氧化物酶标记的试剂
须用不含叠氮钠的封闭液稀释。
（8）用PBS漂洗印迹膜4次，每次换液洗5min。
（9）将经漂洗的印迹膜移至另一干净浅盘中，按印迹膜面积加入0.lml／cm2的底物溶液（若使用碱性磷酸酶标记的二抗，用碱性磷酸酶底物溶液，若用辣根过氧化物酶标记的二抗则用辣根过氧化物酶底物溶液），于室温轻轻摇动，待蛋白条带的颜色深度达到要求（约2-20min），用水略为漂洗，放人PBS中。
（10）拍摄照片，留作永久实验记录（过氧化物酶染色的蛋白条带经日光照射数小时后颜色将退去）。
抗体的性质
影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合。多数多克隆抗血清中或多或少地含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。相反，许多单克隆抗体不能与变性抗原反应，因为它识别的表位依赖于抗原蛋白正确折叠所形成的三维空间构象。表5显示各种抗体的优缺点。
表5 抗体的选择

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基本原理（点击播放）
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印迹法操作流程
印迹法实验膜条 温育槽

样品缓冲液
加样 : 1.5ml/ 槽 *

温育 : 摇摆摇床上振荡 5 分钟 *

吸干 *

已稀释的样本
加样 : 1.5ml/ 槽

温育 : 摇摆摇床上振荡 30 分钟

清洗缓冲液
清洗 : 1.5ml 缓冲液
温育 5 分钟
吸干

酶结合物
加样 : 1.5ml/ 槽

温育 : 摇摆摇床上振荡 30 分钟

清洗缓冲液
清洗 : 1.5ml 缓冲液
温育 5 分钟
吸干

色原 / 底物液
加样 : 1.5ml/ 槽

温育 : 摇摆摇床上振荡 10 分钟

清洗 : 蒸馏水浸洗
吸干

结果判断 : 肉眼判断结果

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