新城疫检疫技术规范

GBl6550—1996

国家技术监督局1996年10月3日批准 1997年2月1日实施

    1 主题内容与适用范围

    本标准规定了新城疫群体检疫、个体检疫、实验室检验和检疫后处理的技术规范。

    本标准适用于鸡和其他可感染新城疫的禽类

    2 引用标准

    GBl6548—1996畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程

    3 群体检疫

    对养禽场、独立饲养的禽群及外售、外运的禽群施行检疫。

    3.1 查明疫病背景

    通过询问兽医人员或检查疫病记录，核查被检禽场（群、室）在过去一年内是否出现过新城疫临诊病例，是否有与新城疫病例接触史，周围2公里范围内是否发生过新城疫。

    3.2 查清免疫状况

    通过查验免疫证明或查询其他资料，核查被检禽群是否已按规定注射合格疫苗。如按规定免疫并正处于规定的保护期内，禽只健康状况良好，被认为免疫合格。如免疫不符合规定要求，要以合格疫苗再次接种，隔离饲养观察至群体抗体滴度达25以上，全群健康，认为免疫合格；观察期内发现疑似新城疫病禽，须按3．3条和3．4条要求进一步检查。

    3.3 群体临诊检查

    首先作静态检查，让禽群处于静止状态，观察营养状况、精神状态、呼吸、粪便、鼻及口腔分泌物有否异常。然后观察禽只运动状况，有否跛行、共济失调、痉挛等异常现象。检查中重点注意以下情况：

    a 精神沉郁或无任何症状而死亡；

    b 体温升高、食欲减退、精神萎顿、产蛋减少或停止；

    c 口腔和鼻腔分泌物增多，嗉囊胀满；

    d 呼吸困难、喉部发出“咯咯”声（晚间较明显）；

    e 下痢，粪便成绿色；

    f 偏头转颈，作转圈运动或共济失调。

    若发现疑似病例，按3.4条要求进一步检查，同时对全群隔离饲养。

    3.4 病理解剖检查

    对临诊疑似病例，应全部或抽样解剖，依据下述病变作出初步判断：

    a 口腔、咽喉部有粘液，咽部粘膜出血；

    b 腺胃乳头肿胀，挤压后有豆腐渣样坏死物流出，乳头有散在的出血点；

    c 肌胃角质下层有条纹状或点状出血，有时见不规则溃疡，腺胃与肌胃交接处有出血斑、条；小肠前段有大面积散在出血点，或肠粘膜有纤维性坏死并形成假膜，假膜下出现红色粗糙溃疡；

    d 小肠前段有大面积散在出血点,或肠粘膜有纤维性坏死并形成假膜，假膜下出现红色粗糙溃疡；

    e 盲肠和直肠皱褶处有出血，盲肠扁桃体（淋巴滤泡）出血坏死；

    f 气管粘膜充血、出血、气管内有粘液；

    g 心冠脂肪、心耳外膜及心尖脂肪上有针尖状小出血点。

    4 个体检查

    4.1 在无群体检疫条件的场合，须进行个体检疫。个体检疫合格的禽只一般供食用，如继续饲养应隔离三周，经观察无异常后，方准与其他禽只混养。

    4.1.1 查明是否来自疫区。

    4.1.2 查验免疫证明。

    4.1.3 临诊检查和病理解剖检查

    检查内容参照3.3条和3.4条进行，发现疑似新城疫染疫禽只，立即作无害化处理。

    5 实验室检验

    5.1 下列情况进行实验室检验

    a． 产地定期检疫；

    b. 监测免疫状态；

    c. 疑似病鸡的定性，或临诊及解剖检查初步诊断为新城疫，需进十步确诊；

    d． 检疫中发现重大疫情（如禽流感），须作鉴别诊断；

    e． 行政主管部门、饲养单位、售购或争议双方要求进行实验室诊断。

    5.2 实验室检验方法

    a． 病毒分离鉴定试验，见附录A（补充件）。

    B． 血凝抑制试验，用于免疫监测，见附录B（补充件）。

    6 检疫后的处理

    6.1 经临床检查、解剖检查和实验室诊断等综合判定，确诊为新城疫的禽群或禽只，按GB 16548处理。

    6.2 经初步诊断为新城疫可疑的禽群（禽只），按下述方法之一处理:

    a. 除将可疑禽只按6.1条处理外，全群隔离饲养，并进行紧急免疫接种，如在接种后观察期内出现可疑禽只，亦按6.1条处理。观察21d后，对临床健康，免疫滴度达到25以上的禽只，经体表消毒后按健康禽只对待。

    B． 经初步诊断为新城疫可疑的禽群（禽只），在全群隔离饲养的同时，对可疑禽只采样作实验室诊断，如确为新城疫者，全群即按6.1条处理。

    6.3 发生过新城疫的禽场在半年之内，其禽只不准出售、外运。

附录A 病毒分离鉴定试验（补充件）

A1 仪器设备

a. 注射器：1ml；

b. 注射针头：5-5? 号；

c. 血凝试验板：v型、96孔；

d. 微量移液器：50μl；

e. 恒温箱；

f. 超净工作台或无菌室。

A2 试剂

a. 无菌生理盐水；

b. 青霉素；

c. 链霉素；

d. 标准阳性血清。

A3 样品采集及处理

A3.1 活禽用气管拭子和泄殖腔拭子（或粪）。

A3.2 死禽以脑为主；也可采心、肝、脾、肺、气囊等组织。

A3.3 样品用生理盐水研成1:5乳液；拭子浸入2-3ml生理盐水中，反复吸挤压至无水滴出，弃之。溶液中加入青霉素（使终浓度为1000 单位/ml）、链霉素（使终浓度为1mg/ml）。泄殖腔拭子（或粪）样品，青霉素、链霉素量提高5倍。然后调pH7.0-7.4，37℃作用1h，再1000r/min离心10min，取上清0.1ml经尿囊腔接种9-10日龄SPF鸡胚。

A4 培养物的收集及检测

A4.1 培养:4-7d的尿囊液经无菌采集后-20℃保存。

A4.2 尿囊液按附录B（补充件）作血凝试验，并与标准阳性血清作血凝抑制试验，确定有无新城疫病毒繁殖。

A4.3 MDT（最小病毒致死置引起鸡胚死亡的平均时间）的测定：将新鲜尿囊液用生理盐水连续10倍稀释，10^-6-10^-9 的每个稀释度接种5个9-10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，37℃孵化。余下的病毒保存于4℃,8h后以同样方法接种第二批鸡胚，连续7d内观察胚死亡时间并记录，测定出最小致死量，即引起被接种鸡胚死亡的最大稀释倍数。计算MDT。

A4.4 以MDT确定病毒的致病力强弱，40-70h死亡为强毒，140h以上为弱毒。

附录B 鸡新城疫微量红细胞凝集抑制试验（补充件）

B1 仪器设备

a. 微量血凝板：v型、96孔；

b. 微型振荡器；

c. 塑料采血管；

d. 移液器：50μl。

B2 试剂

B2.1 稀释液

Ph7.0-7.2磷酸缓冲盐水

氯化钠（GB1266-77）   170g

磷酸二氢钾（GB1244-77） 13.6g

氢氧化钠（GB629-77）    3.0g

蒸馏水                  1000ml

高压灭菌，4℃保存，使用时作20倍稀释

B2.2 浓缩抗原

B2.3 0.5%红细胞悬液

采成年鸡血，用20倍量磷酸缓冲盐水洗涤3-4次，每次以2000r/min离心3-4min，最后一次5min，用磷酸缓冲盐水配成0.5%悬液。

B2.4 标准阳性血清

B3 被检血清

每群鸡随机采血.20-30份血样，分离血清。

采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6-8cm长。将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以1000r/min离心5min，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中。若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于0℃保存。

B4 操作方法

B4.1 微量血凝试验

B4.1.1 于微量血凝板（B1.1）的每孔中滴加稀释液（B2.1）50pl，共滴四排。

B4.1.2 吸取1:5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔50μl，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取50μl弃之。最后一列不加抗原作对照。

B4.1.3 于每孔中加入50%红细胞恳液（B2.3）50μl。

B4.1.4 置微型振荡器（B1.2）上振荡1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。

B4.1.5 放室温下(18-20℃)30-40min，根据血凝图象判定结果。以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次四排重复，以几何均值表示结果。

B4.1.6 计算出含4个血凝单位的抗原浓度。按式（B1）进行计算：

抗原应稀释倍数=血凝滴度/4

B4.2 微量血凝抑制试验

B4.2.1 先取稀释液(B2.1)50μl，加入微量血凝板（B1.1）的第1孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入3-12孔，每孔50μl，第2孔加浓度为8个血凝单位的抗原50μl。

B4.2.2 吸被检血清(B3)于第1孔（血清对照）中，挤压混匀后吸50μl于第2孔，依次倍比稀释至第12孔，最后弃去50μl。

B4.2.3 置室温（18-20℃）下作用20min。

B4.2.4 滴加50μl 0.5%红细胞悬液（B2.3）于各孔中，振荡混合后，室温下静置30-40min ,判定结果。

B4.2.5 每次测定应设已知滴度的标准阳性血清（B2.4）对照。

B5结果判定

B5.1在对照出现正确结果的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度。

B5.2 若有10%以上的鸡出现11(log2)以上的高血凝抑制滴度，说明鸡群已受新城疫强毒感染。

B5.3 若监测鸡群的免疫水平，则血凝抑制滴度在4(log2)的鸡群保护率为50％左右；在4（log2）以上的保护率达90%-100%；在4（log2）以下的非免疫鸡群保护率约为9%，免疫过的鸡群约为43%。鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示，如平均水平在4（log2）以上，表示该鸡群为免疫鸡群。