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神经营养因子治疗脊髓损伤的研究进展
中国脊柱脊髓杂志 1998年第2期第8卷 综述
作者：邓少丽1　廖维宏1
单位：1　第三军医大学野战外科研究所三室　400042　重庆市大坪
　　神经营养因子家族的成员包括神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养素Ⅲ（NT-3）、神经营养素Ⅳ/Ⅴ（NT-4/5）及新近发现的神经营养素Ⅵ（NT-6）等。它们在体内和离体情况下，具有维持损伤脊髓神经元的存活、促使轴突延伸等功能。另外与SCI后功能康复有关的还有肝素结合性生长因子家族（Heparin-binding growth factors) ，包括酸性成纤维生长因子（aFGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）等细胞因子〔1〕，在此篇不作专门介绍。
　　1　神经营养因子对脊髓的作用
　　自1952年，Leve-montalcini首次发现一种“促神经生长物”NGF以来，人们逐渐认识到：神经细胞的发育、生存、生长、迁移以及与其它细胞建立功能性联系，或在神经再生过程及轴突的再生长中，均受一类可溶性化学物质——神经营养因子（Neurotrophic factors,NTFs）的诱导、调节和控制。
　　近年来，神经营养因子对基底前脑、丘脑、黑质、脑干及皮质等部位的作用及对这些部位损伤后的修复机制都有陆续报道〔2〕。但关于脊髓对神经营养因子的反应性及NTFs对脊髓损伤后的修复作用所知甚少。
　　NTFs具有刺激多种神经元存活和分化的功能，但各种因子的靶细胞群既有区别又有交叉。NGF主要作用于神经嵴起源的发育期中的感觉神经元和交感神经元及前脑基底部某些胆碱能神经元。因为NGF与NGF受体（NGFR）结合才能发挥效应，故依据NGFR在脊髓中的分布可了解NGF在脊髓中的作用部位。鼠颈髓具有NGFR的神经元主要集中于第Ⅶ板层及远端颈髓的第Ⅵ板层中，在中段颈髓的第Ⅸ板层中部有少量大神经元呈较弱的NGFR免疫反应〔3〕，提示NGF对颈髓第Ⅵ、Ⅶ板层及前角部分神经元有持续作用；在鼠胸髓中仅背角核呈NGFR免疫反应〔4〕，其运动神经元未见NGFR免疫反应；在鼠腰髓前角运动神经元发育期有NGFmRNA表达，此mRNA在胚胎第13～14天达高峰，前角运动神经元细胞在胚胎第15天至出生后10d,其NGFR免疫反应较强〔5〕。成年动物腰髓第Ⅸ板层的中央或腹侧神经元有NGFR表达，这些神经元在给予NGF后体积增大，提示成年脊髓运动神经元可能对NGF有反应〔3〕。以上说明NGF主要对脊髓中感觉、交感神经元起作用，但对前角部分运动神经元也有一定作用。Tuszynski等〔2〕在成鼠SCI后，通过基因转移NGF的研究中证实，NGF能诱导感觉和去甲肾上腺素能神经元纤维进行较大延伸，使局部运动神经元纤维也出现发芽现象。Fernandez等〔6〕的研究结果还提出：成鼠脊髓横切后，局部注入NGF可加速皮质脊髓束发芽。
　　1990年，Hohn等发现了BDNF。BDNF具有NGF 50%同源性，其对多种感觉神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元以及GABA能神经元的发育分化与生长再生具有维持和促进作用。BDNF对交感和睫状神经节不起作用，但能阻止坐骨神经横切后大量运动神经元的死亡，且能挽救脊髓半切伤后的红核神经元〔7〕。Goto〔8〕等利用BDNF和NT-3的抗体，调查了大鼠脊髓横切伤后BDNF和NT-3样免疫反应分布，证实BDNF和NT-3的免疫反应都定位于灰质，尤其是前角的运动神经元及白质的一些轴索胶质细胞。在脊髓横切损伤模型中，损伤后3周，运动神经元显示抗NT-3抗体强阳性，而抗BDNF抗体稍弱。损伤后4周，灰质中星状细胞显示抗BDNF抗体阳性，而且还证明，BDNF和NT-3都参与了脊髓修复过程。因此，利用BDNF挽救脊髓损伤神经元很有潜力。
　　NT-3和NT-4/5为感觉神经元的营养因子，但在阻止损伤后运动神经元死亡的作用上，NT-4/5与BDNF有相同效应〔9〕。在发育中及成熟后的大鼠中，NT-3都能促进脊髓损伤后皮质脊髓束的生长〔10〕，且能阻止大鼠发育中损伤红核神经元的退行性死亡〔7〕。NT-6是新发现的神经营养因子家族成员〔11〕，对脊髓损伤治疗前景还知之甚少。以上资料显示：神经营养因子对脊髓损伤可能有一定治疗作用。
　　2　神经营养因子受体与信号传导机制
　　神经营养因子通过与反应神经元细胞表面的受体结合而起作用。活性配体-受体复合物通过内在化内吞(internalize)作用进入细胞，并逆行沿轴突运输至神经元胞体，在胞体可激活转录机制引起多种蛋白合成，从而发挥对神经元的作用。NTFs受体分为高亲和力（kd=10-11)和低亲和力（kd＞10-9)受体。高亲和力受体能辨别不同NTFs，并能传导大部分生物效应。
　　1991年研究发现，对NGF有高亲和力的为一分子量为140KD的受体，本质是由原癌基因trk编码的酪氨酸蛋白激酶，称为trkA或P140trkA。此外由trk相关基因trkB编码的蛋白，分子量为145KD，已被证实可结合BDNF和NT-3，称为P145trkB。trk家族的第三个成员trkC已被克隆，其功能类似于一个高亲和力的NT-3受体，分子量145KD，称为P145trkC〔12〕。NT-3可结合trkA，但并不引起PC-12细胞的分化。部分纯化的NT- 4/5可激活trkB、trkA。这种一个因子激活多个受体，单个受体结合多个因子的现象，不仅使神经组织可同时获得多种营养支持，还可使一个靶组织表达不同的NTFs而建立不同的功能。
　　低亲和力受体分子量为75KD，故又称P75或P75NGFR。它能结合所有NTFs，但生理学意义仍不明了。P75是一细胞表面糖蛋白，由一结合NTFs的细胞外区、跨膜区及一短的细胞质区构成，它缺乏信号传递装置，当这种受体单独表达时，不能使细胞对NTFs产生生物效应〔13〕。在trkA形成及对NTFs反应中，P75是非常必要的。P75与trk结合表达可使受体对NTFs的反应性比trk单独表达时增高。没有P75的表达，NT-3不能结合trkA〔1〕，故P75可增加trk受体对NTFs的特异性。并且还发现P75与TNF-Ⅰ、TNF-Ⅱ受体，B细胞抗原CD40有序列同源性，有调控神经细胞程序死亡的作用，该作用可因结合NGF而被抑制。
　　3　利用NTFs对脊髓损伤的治疗途径
　　近二十年来，大量的研究工作证实损伤的中枢神经具有可塑性，也能再生。脊髓损伤的治疗便成为人们感兴趣的研究领域。在以往用来促进损伤脊髓恢复的治疗方法中，包括移植胚胎组织、给予髓鞘相关蛋白抗体、外周神经搭桥术及提供使轴突生长的基质等方法〔2〕，但这些方法使神经元恢复的数量远不尽如人意。
　　人们发现，脊髓损伤后，NTFs及受体表达增加，出现自我保护反应。Wrathall等研究结果表明，在鼠脊髓中胸段损伤后，P75表达持续增加，且首先表现在损伤部位。同时内源性NGF、BDNF、NT-3等NTFs增多，自发挽救神经元的退化、死亡。这提示了NTFs是治疗SCI的有效成分。
　　神经营养因子是一种蛋白质，在正常情况下不能通过血脑屏障及脊髓屏障。而NGF等只有与神经终末的NGFR类受体结合，通过内在化内吞作用入轴突，再沿神经微管逆行至胞体，才能发挥其生物效应。因此，通过必要的手段直接进入脊髓或其周围，才能使NTFs发挥最佳效果，所以需借助导管将NTFs注入蛛网膜下腔，这种方法在操作上的复杂性限制了临床的实际应用。Friden〔14〕等致力于寻找一种能通过血脑屏障的NGF可溶形式，或一种具NGF生物活性的合成物质。他们发现，生物合成碱，如stauroporine、K252系列以低浓度作用于离体系统，能成功地复制出神经营养因子的生物效应。人们还发现，神经节苷脂（GM1）能在培养的神经细胞中传递与NGF相似的神经营养效应。尤为重要的是，Geisler等报道用GM1能加强人脊髓创伤后神经学康复。GM1的作用机制仍不清楚，近来资料表明GM1可能通过诱发trkA的生理学活性而发挥NGF样生物效应。
　　用一种药物加强NTFs的生物合成也不失为一种有效治疗途径。多次实验结果证实，一些药物能在体内增强不同营养因子的表达。这些药物包括糖皮质素（glucocorticoids）、白介素-1（IL-1）、 clenbuterol等。现在更多研究兴趣集中于NBQX，一种AMPA谷氨酸受体亚型的拮抗剂。据称，NBQX能促进SCI后的功能恢复〔15〕。
　　随着分子生物学技术的进展，基因治疗引入了CNS的治疗方法。神经系统基因治疗的两种基本途径是体内直接基因治疗和体内间接基因治疗。间接法步骤复杂，但技术较为成熟；直接法简便迅速，技术尚在完善中，但具许多优点，更接近于临床应用。特别是近年来研究发现，一些重组病毒表达载体能将外来基因直接导入在体或离体培养的神经细胞，这就使SCI的基因治疗获得突破性进展充满了希望。以前基因治疗中转移病毒多用逆转录病毒载体，这种载体要求靶细胞必须有分裂和增殖特性，因此将它用于神经元的希望很小。目前研究较多的有腺病毒载体（AV），腺病毒相关病毒载体（AAV）以及单纯疱疹病毒载体（HSV）等，已有实验证实这几种病毒载体可以感染很多种不分裂细胞（包括神经元），故能将外源基因直接导入神经细胞。尤其是AAV载体，它具有独特的优点和巨大的潜力，现被认为是神经系统基因治疗中最有前途的高效载体〔16、17〕。
　　脊髓基因治疗的基础研究已有了一定进展。其方法是向脊髓损伤部位移植能产生神经营养因子的遗传修饰细胞，以提供促进神经元生长的微环境。用于神经系统疾病基因治疗的遗传修饰细胞种类较多，其中包括胶质细胞、胚胎神经元等神经细胞，还有成纤维细胞、成肌细胞等非神经细胞。Tuszynski〔2〕 等采用大鼠脊髓半横切模型，用基因转移方法，将人NGF的cDNA，以来源于莫罗尼小鼠白血病病毒的重组逆转录病毒为载体，引入Fischer 344鼠的原始成纤维细胞，最后将此产NGF的细胞移入损伤部位。结果表明，损伤的感觉神经元、去甲肾上腺素能神经元纤维得到了快速、旺盛的生长，运动神经元纤维也向损伤移植处延伸，而未移植细胞的对照组无此现象。因此，基因转移NGF的方法明显促进了损伤脊髓的结构、功能恢复，并且效果好于NGF直接注入法。Ronald〔18〕等人的研究也证实在CNS损伤后采用基因转移技术，以阳离子脂质体为载体转移BDNF cDNA，能够挽救神经微丝的丢失，促进细胞骨架重组。
　　4　利用NTFs治疗脊髓损伤的前景与展望
　　神经营养因子在体内不是起单纯的神经营养作用，它具有多功能性。又由于它们对靶细胞的选择性，在神经系统损伤后再生的瀑布式事件中很可能仅仅作用于某一环节。加上多种神经营养因子的作用必然相互影响，而遗憾的是对各种因子的整合机制目前仍是茫然无知。因此，神经营养因子在体内的作用机制还需深入研究，利用基因转移治疗脊髓损伤也存在基因转移效率有待提高、移植细胞的长期生存和有效表达尚待解决等问题。
　　令人可喜的是，目前利用NTFs治疗SCI的实验室报告给我们展示了诱人的临床应用前景。我室〔19〕 已证实胚胎脊髓除可促进成体损伤脊髓再生外，也能抑制胶质细胞增生和空洞的形成。Schnell在脊髓半切模型中，用NT-3同髓鞘相关蛋白抗体配伍，结果使5%～10%的皮质脊髓束纤维得到再生，轴突生长的距离达15～20mm，这个数值较胚胎脊髓移植等方法提高了一个数量级。国内王振宇〔20〕 将NGF应用于胚胎脊髓组织移植，结果移植物充满损伤腔，与宿主脊髓形成良好融合，移植组织与宿主组织出现新的纤维联系，使脊髓损伤的两端恢复了解剖连续性。可以设想，将NTFs基因转移技术与胚胎组织移植技术联合运用于治疗SCI，局部释放的NTFs可不断促进胚胎神经发育、持续吸引宿主神经纤维再生，使两者间形成更多更远的纤维交错及更多的突触连接，有可能进一步提高脊髓损伤的修复水平。伴随分子生物学技术的迅速发展，神经营养因子及受体研究的进一步深入，我们有理由期盼NTFs治疗脊随损伤的美好前景。本文来自:大众医药网
http://www.51qe.cn/pic/30/15/14/23/12/0581.htm