神马文学网SPA的提取、纯化与鉴定（煮沸提取法和溶菌酶消化法）|蛋白质实验室-生技论坛-生命科学的交...
来源：百度文库 编辑：神马文学网 时间：2024/04/29 20:28:37
（一） SPA的提取
SPA提取的方法很多，包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等。现将常用的方法介绍如下：
1．煮沸提取法
⑴ 将菌株接种于蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上，37℃培养20h~24h。
⑵ 以 0.15mol/L pH5.9PB液将菌苔洗下，配成10%(V/V)的悬液。
⑶ 水浴中煮沸1h，迅速冷却至4℃，4 000r/min离心20min，去沉淀。
⑷ 以1mol/LHCl将上清液调pH至3.0~3.5，然后4 000r/min离心30min。
⑸ 沉淀以pH5.9PB溶解，然后12 000r/min离心20min。
⑹ 上清液加4.7倍量的95%酒精，充分混合后，.4 000r/min离心20min。
⑺ 沉淀(可直接冻干为粗提SPA制品)加PH7.4PBS液溶解，12 000r/min离心 20min。
⑻ 上清液即为粗提SPA液。
⑼ Sephadex G100过柱，上样后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脱，流速控制在每管2ml~3ml/20min，收集流出液。 ⑽ 测OD275nm值及用对流免疫电泳检测每管的活性，将有活性的各管合并、浓缩或冻干。
2．溶菌酶消化法
⑴ 将培养的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris－HCl缓冲液配成 10%~15%的悬液。
⑵ 按20:1(W/W)的量加入SPA菌液与溶菌酶(活力为1万U/mg蛋白)37℃水溶搅拌24h。
⑶ 置 4℃冷却后，以12 000g离心30min。
⑷ 取上清，调pH值至7.0。
⑸ 加硫酸铵，边加边搅拌，使溶液呈80%的饱和度，4℃过夜。
⑹ 12 000g离心30min。
⑺ 以少量蒸馏水将沉淀溶解。
⑻ 透析或过Sephadex G50除盐，即为粗制的SPA制品。
2．Sphadex G100凝胶过柱法
装柱、加样，以 0.05mol/L pH7.4 PBS洗脱，收集洗脱液，如上法测定活性和蛋白含量。
3．亲和层析法
(1) 猪IgG的制备：取正常猪血清，硫酸铵提取γ球蛋白，再过DEAE－纤维素－32柱，制得纯化的IgG，以0.1mol/L NaHCO3液平衡，配成 4mg~5mg/ml溶液。
(2) 偶联：将固体溴化氰1.2g溶于20ml蒸馏水中，倾入容积为15ml的Sepharose－4B中，搅拌，同时滴加2mol/L NaOH使pH维持在11.0，反应8min，用500ml预冷的0.1mol/L NaHCO3在2 号砂芯漏斗上洗脱已活化的Sepharose－4B(在90Sec内洗脱完毕)，迅速加入IgG液15ml，于4℃缓慢搅拌过夜，次日以PBS充分洗涤，至洗出液OD280nm＜0.02为止。加入30ml 1.0mol/L乙醇胺洗柱，以封闭残余活性基团，再以PBS洗至中性为止。
(3) PBS亲和层析：将粗制SPA溶于PBS液中，加入IgG－Sepharose－4B柱，流速0.2ml/min，以PBS洗至 OD280nm＜0.02为止，换用0.1mol/L pH2.3甘氨酸－盐酸缓冲液洗脱，流速0.2ml/min，收集洗脱液，即为纯化的SPA，对流电泳检查SPA活性，收集，浓缩，保存。
（三）纯化SPA的鉴定
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，只出现一条沉淀带为纯品。据报道，常出现一条杂蛋白染色带。以亲和层析法提纯的纯度高。
（二）SPA的纯化
1．DEAE－Sephadex A－25 离子交换层析法
⑴ 用0.1mol/L NH4HCO3缓冲液平衡 DEAE－Sephadex A－25柱。
⑵ 加样后，用0.1mol/L NH4HCO3缓冲液洗脱12h~14h。
⑶ 改用0.4mol/L NH4HCO3缓冲液洗脱，流速 0.15ml~0.2ml/min，收集流出液，测OD275nm。
⑷ 测SPA活性(以对流免疫电泳)，能与人及猪正常血清产生沉淀线的各管合并。
⑸ 浓缩或冻干保存。
SPA提取的方法很多，包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等。现将常用的方法介绍如下：
1．煮沸提取法
⑴ 将菌株接种于蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上，37℃培养20h~24h。
⑵ 以 0.15mol/L pH5.9PB液将菌苔洗下，配成10%(V/V)的悬液。
⑶ 水浴中煮沸1h，迅速冷却至4℃，4 000r/min离心20min，去沉淀。
⑷ 以1mol/LHCl将上清液调pH至3.0~3.5，然后4 000r/min离心30min。
⑸ 沉淀以pH5.9PB溶解，然后12 000r/min离心20min。
⑹ 上清液加4.7倍量的95%酒精，充分混合后，.4 000r/min离心20min。
⑺ 沉淀(可直接冻干为粗提SPA制品)加PH7.4PBS液溶解，12 000r/min离心 20min。
⑻ 上清液即为粗提SPA液。
⑼ Sephadex G100过柱，上样后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脱，流速控制在每管2ml~3ml/20min，收集流出液。 ⑽ 测OD275nm值及用对流免疫电泳检测每管的活性，将有活性的各管合并、浓缩或冻干。
2．溶菌酶消化法
⑴ 将培养的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris－HCl缓冲液配成 10%~15%的悬液。
⑵ 按20:1(W/W)的量加入SPA菌液与溶菌酶(活力为1万U/mg蛋白)37℃水溶搅拌24h。
⑶ 置 4℃冷却后，以12 000g离心30min。
⑷ 取上清，调pH值至7.0。
⑸ 加硫酸铵，边加边搅拌，使溶液呈80%的饱和度，4℃过夜。
⑹ 12 000g离心30min。
⑺ 以少量蒸馏水将沉淀溶解。
⑻ 透析或过Sephadex G50除盐，即为粗制的SPA制品。
2．Sphadex G100凝胶过柱法
装柱、加样，以 0.05mol/L pH7.4 PBS洗脱，收集洗脱液，如上法测定活性和蛋白含量。
3．亲和层析法
(1) 猪IgG的制备：取正常猪血清，硫酸铵提取γ球蛋白，再过DEAE－纤维素－32柱，制得纯化的IgG，以0.1mol/L NaHCO3液平衡，配成 4mg~5mg/ml溶液。
(2) 偶联：将固体溴化氰1.2g溶于20ml蒸馏水中，倾入容积为15ml的Sepharose－4B中，搅拌，同时滴加2mol/L NaOH使pH维持在11.0，反应8min，用500ml预冷的0.1mol/L NaHCO3在2 号砂芯漏斗上洗脱已活化的Sepharose－4B(在90Sec内洗脱完毕)，迅速加入IgG液15ml，于4℃缓慢搅拌过夜，次日以PBS充分洗涤，至洗出液OD280nm＜0.02为止。加入30ml 1.0mol/L乙醇胺洗柱，以封闭残余活性基团，再以PBS洗至中性为止。
(3) PBS亲和层析：将粗制SPA溶于PBS液中，加入IgG－Sepharose－4B柱，流速0.2ml/min，以PBS洗至 OD280nm＜0.02为止，换用0.1mol/L pH2.3甘氨酸－盐酸缓冲液洗脱，流速0.2ml/min，收集洗脱液，即为纯化的SPA，对流电泳检查SPA活性，收集，浓缩，保存。
（三）纯化SPA的鉴定
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，只出现一条沉淀带为纯品。据报道，常出现一条杂蛋白染色带。以亲和层析法提纯的纯度高。
（二）SPA的纯化
1．DEAE－Sephadex A－25 离子交换层析法
⑴ 用0.1mol/L NH4HCO3缓冲液平衡 DEAE－Sephadex A－25柱。
⑵ 加样后，用0.1mol/L NH4HCO3缓冲液洗脱12h~14h。
⑶ 改用0.4mol/L NH4HCO3缓冲液洗脱，流速 0.15ml~0.2ml/min，收集流出液，测OD275nm。
⑷ 测SPA活性(以对流免疫电泳)，能与人及猪正常血清产生沉淀线的各管合并。
⑸ 浓缩或冻干保存。
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