叶绿体色素提取方法的几个问题1

来源：百度文库 编辑：神马文学网 时间：2024/04/29 17:37:08

叶绿体色素提取方法的几个问题

在高中《生物》的实验教学中，“叶绿体中色素的提取与分离”实验既比较复杂又非常重要。其中提取绿色叶片中的色素是这一实验中最关键的步骤。色素提取液的质量直接影响到分离效果的好坏乃至整个实验的成败。《生物学教学》近几期刊登了几位作者对这一步骤的改进，笔者通过实验，对实验原理提出了新的见解，并据此对实验方法进行了改进。

一、关于丙酮的用量

教材要求研磨时加2毫升丙酮，由于丙酮挥发性太强，研磨后只能形成糊状物，难以过滤出滤液。经过实验，将丙酮的用量提高到7～10毫升较好。

二、关于碳酸钙的作用

叶绿素是一种含镁的化合物，其中的镁易被H-、Cu2+、Zn2-等取代。当被H-取代后，就形成去镁叶绿素，呈黄褐色。虽然研磨过程中不发生产生大量H+的化学反应，但液泡中常含有多种有机酸。一般认为，碳酸钙的作用在于中和研磨过程中产生的H+，以防止叶绿素被破坏。实验证明，不加碳酸钙研磨产生的色素提取液与相同条件下加碳酸钙研磨产生的色素提取液颜色相差无几，可见色素的损失并不大。但将提取液加塞后在暗处放置几小时，前者变黄而后者无显著变化，说明前者叶色素容易遭到破坏、证明碳酸钙确能防止色素的破坏。

三、关于研磨的问题

教材要求“迅速充分地研磨”。“迅速”当然是为了缩短研磨时间，以减少丙酮的挥发。“充分”要达到什么程度呢？实验证明，用5克绿叶加10毫升丙酮及少许二氧化硅和碳酸钙，迅速研磨1分钟左右，此时叶片未被研细，尚有很多叶片呈碎片状，显然研磨并不充分(本文姑且称这种研磨程度为“研磨适当”)，但过滤后能得到浓绿的色素提取液。用这种提取液在滤纸条上重复划线8次后分离，色带仍较淡，说明这种色素提取液浓度还是小。

实验时常有一些学生为了“研磨充分”而出现研磨时间过长的问题。这时所有的叶片均被研细，与丙酮混合成糊状匀浆(本文姑且称这种研磨程度为“研磨过度”，实际上恰是“研磨充分”)。这时无论研磨前是否加碳酸钙，滤液均呈黄色。这样的滤液无法用于分离实验。显然，“迅速”和“充分”在这里发生了矛盾。“迅速”则不充分，“充分”滤液却呈黄色。对这一现象的解释，一种流行的观点认为研磨时间过长使色素遭到破坏造成了滤液呈黄色。但细心观察就会发现，这时的滤渣仍为浓绿色。将滤渣倒回研钵，再加5毫升丙酮，搅拌均匀后进行二次过滤。结果无论研磨前是否加了碳酸钙，滤液均呈极浓的绿色，在0.5厘米内径的小试管中几乎不透明，比研磨适当时得到的色素提取液要浓得多。这种提取液用于分离，效果很好。可见，色素并没有因研磨时间过长而被破坏，研磨时间过长时滤液呈黄色是因为色素被吸附到滤渣中，没能进入滤液。

是什么原因造成了这种吸附呢？取上述研磨过度时的滤渣(色素均吸附在其中)3毫升左右放入试管中，再加入2毫升丙酮，振荡均匀后静置，几分钟后出现极浓绿的澄清液，说明色素被提取出来了。然后问试管中逐滴滴入清水，每滴5滴振荡均匀后静置，观察颜色变化，发现滴入水量越多，澄清液颜色越浅，同时滤渣颜色越深。5～6次后(已滴入1～1.5毫升水)，澄清液呈浅黄绿色，色素又重新被吸附到滤渣中。将这些浅黄绿色的澄清液(主要是水和丙酮的混合物)倒出，向试管中的沉淀渣中再加2毫升丙酮，振荡后静置，澄清液再次呈浓绿色，如此可反复进行。可见，色素能否被提取出来，关键在于提取液中丙酮与水的比例。这实质上是一个溶解问题。若含水多，由于这些色素均不溶于水，则色素被吸附在滤渣中，滤液呈黄色；若含丙酮多，则色素溶解进入滤液，滤液呈绿色。5克新鲜菠菜叶中含有相当数量的水，当加入的丙酮量一定时，研磨时间越长，丙酮挥发越多，研磨液中剩余的丙酮比例就越小，提取出的色素也就越少，以致呈黄色。

如果用干燥剂对色素提取液进行吸水处理，效果如何呢？将研磨适当的提取液加3～5克无水硫酸钠后再过滤，所得滤液比加硫酸钠前的提取液颜色稍深。但从实验结果来看，这种提取后去除水的方法滤液损失多，且效果并不很显著，同时增加了实验步骤和药品消耗，使实验复杂化，不宜采用。

用研磨适当时产生的滤渣加5毫升丙酮二次提取。结果这第二次滤液比第一次滤液色泽还浓绿，说明滤渣中仍有大量色素。但这研磨适当时的二次滤液比研磨过度时的二次提取液还是淡得多，这是因为第一次过滤时已有一部分色素进入了滤液，而更重要的是因为研磨不充分，色素难以从叶绿体中提取出来。

怎样才能既利用了研磨充分时细胞结构得到充分破坏使色素易于提取这一优点，同时又提高提取液中丙酮的比例呢？经过反复实验，笔者进行了如下改进：采用室内预先阴晾半天的叶片3克(经测定，新鲜时重5克以上，即减少水2克以上)，加3毫升丙酮及少许二氧化硅和碳酸钙，将叶片充分研细，再加入5毫升丙酮，搅拌均匀后过滤。所得提取液色素虽不如研磨过度时滤渣二次提取液浓，但比研磨适当时的提取液浓得多。若研磨后直接过滤，再用5～7毫升丙酮分2～3次洗涤滤渣，所得提取液更浓，只是操作稍复杂一点。

这一改进提高了色素提取液的浓度，减少了划线重复次数，提高了分离后色素带的清晰度，同时又不需二次过滤，是一种较好的实验方案。采用这一方案后，学生实验的成功率基本上达到100％，且分离效果良好。

　

吕维栋，生物学教学，1996年第1期
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