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分子诊断技术原理

       20世纪50年代Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型，标志着分子生物学作为一门独立学科的诞生，70年代以来，分子生物学已成为生命科学领域最具有活力的学科前沿。由于分子生物学理论和技术方法不断地被应用于临床，在疾病和预防、预测、诊断、疗效地评价等多方面发挥着愈来愈重要的作用。分子生物学与临床医学的广泛交叉和渗透，产生了一个崭新的学科方向—分子医学；70年代末，美国科学院院士美籍华裔科学家Kan等应用液相DNA分子杂交成功地进行了镰形细胞贫血症的基因诊断，标志着检验诊断进入基因诊断时代，由于基因诊断是从疾病基因或与致病相关的基因及其表达产物的水平上进行检测，因此实现了疾病的早期诊断，但由于基因诊断方法以现代分子生物学技术为基础并有机整合了细胞学、遗传学等技术，使基因诊断更具有先进性，精确性和快速，因此大大提高了诊断的特异性和灵敏度。

        长期以来，疾病的诊断主要依据病史、症状、体征和各种辅助检查，如血液学、病理学、免疫学、微生物学、寄生虫学乃至物理学检查等。然而，上述检查方法都具有其各自的局限性，使得许多疾病未能被及时准确地诊断，从而延误了治疗良机。因为许多外科疾病在病人出现症状、体征及生化改变之前就已存在相当一段时间，所以人们一直在盼望能找到一种技术，在疾病一旦发生，甚至尚未出现症状、体征及生化改变之前，就能做出诊断；对于某些可能的致病因素，包括食品、水质、环境中存在的病原体，人们也期望能有简单准确的方法及时进行检测。随着基因诊断技术的不断改进和日臻成熟，其涉及领域和应用范围不断扩大，特别是80年代中期聚合酶链反应（PCR）技术的问世以及90年代初人类基因组计划的启动，进一步推动了基因诊断技术的发展。分子生物学技术的发展使人们渴望已久的上述愿望得以实现，1999年11月，美国研究病理学会和分子病理学协会创刊出版了《The Journal of Molecular Diagnostics》杂志，标志着这种在分子生物学理论和技术发展基础上建立起来的一门全新的诊断技术已经发展成为一个成熟的学科——分子诊断学。

        分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据，回顾分子诊断学20余年的发展历史，大致经历了3个阶段：
        （1）利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断；
        （2）以PCR技术为基础的DNA诊断，特别是定量PCR和实时PCR的应用，不仅可以检测存在于宿主的多种DNA和RNA病原体载量，还可检测多基因遗传病细胞中mRNA的表达量。
        （3）以生物芯片（biochip）技术为代表的高通量密集型检测技术，生物芯片技术包括基因芯片，蛋白质芯片，组织芯片等，由于其工作原理和结果处理过程突破了传统的检测方法，不仅具有样品处理能力强、用途广泛、自动化程度高等特点，而且具有广阔和应用前景和商业价值，因此成为分子诊断技术领域的一大热点。
分子诊断学的发展历史已揭示了其发展方向：
        1）分子诊断的内容从传统的DNA诊断发展到核酸及其表达产物（mRNA、蛋白质）的全面诊断；
        2）分子诊断的策略从利用分子杂交、PCR等单一技术的诊断发展到有机组合多项技术的联合诊断；
        3）分子诊断的方法从定性诊断发展到半定量和定量诊断，核酸标记技术，特别是荧光标记技术的发展，荧光定量PCR技术等方法日益成熟；
        4）分子诊断的范围从单基因疾病（门德尔遗传性疾病，诸如白血病、早老症、血红蛋白病、甲型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒，人乳头瘤病毒等）的诊断发展到多基因病（肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等）的诊断；
        5）分子诊断的应用多治疗性诊断发展到预防性分析评价，特别是针对高危人群进行疾病基因或疾病相关

生物大分子主要指核酸(DNA和RNA)和蛋白质，通过从分子水平上完成DNA, RNA或蛋白质检测，从而对疾病作出诊断的方法称为分子诊断，目前常用的方法有基因诊断和肿瘤标志物检测两种。
       （1）基因诊断
       基因诊断是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基因的功能，从而对人体状态与疾病做出诊断的方法。 人体基因组的类型早在受精卵开始时就已形成，因此在人体发育的任何时期，只要获得受检者的基因组DNA，应用恰当的DNA分析技术，便能鉴定出缺陷的基因，而不论该基因产物是否已经表达。而且，应用这一方法，不仅能够检测单个碱基置换、缺失和插入等，还能发现DNA的多态现象以及遗传病的异质性。基因诊断检测的目标分子是DNA或RNA，反映基因的结构和功能。检测的基因有内源性(即机体自身的基因)和外源性(如病毒、细菌等)两种，前者用于诊断基因有无病变，后者用于诊断有无病原体感染。
       基因诊断的意义在于不仅能对某些疾病做出确切诊断，如确定某些遗传病，也能确定基因与疾病有关联的状态，如对疾病的易感性、发病类型和阶段的确定等。就目前已经开展的工作而言，外科领域的遗传性疾病、遗传易感性疾病、多种恶性肿瘤、感染性疾病、器官移植反应等都可以用基因诊断的方法加以诊断。
       基因诊断的主要技术有核酸分子杂交、聚合酶链反应和生物芯片技术。
       1．核酸分子杂交技术
       1）原理：
       具有一定互补序列和核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程，称为核酸分子杂交。杂交的双方是待测核酸序列和探针序列。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。
       2）基因探针及其标记：
       基因探针是一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列，可以是DNA或RNA，长度不一，可为完整基因，也可为其中一部分。根据探针的来源和性质分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针。作为探针至少必须满足两个条件，一是应为单链(或通过变性形成单链)，二是应带有可被示踪和检测的标记。有了合适的探针，就有可能检测出目的基因，观察有无突变，也可根据探针的结合量进行定量检测。在与DNA样本杂交过程中，借助上述标记物可探察出特异性或差异性DNA。双链DNA的变性和复性特点是本技术的基础。经加热，或在强酸、强碱作用下，双链DNA氢键被破坏，双股链分离，变成单链（此即变性）；而当条件缓慢变为中性或温度下降（50oC左右）时，氢键恢复，分开的两股单链又重新合为互补的双链结构（此即复性）。DNA探针分子杂交就是将样本DNA分子经上述条件处理后，使其变性为单链状态，固定在载体硝酸纤维膜上，再与经小分子标记的DNA探针单链分子混合，在一定条件下使它们互补杂交结合。将未杂交的成分洗脱后，标记物显色，即可观察结果。选择探针最基本的原则是要有高度特异性，其次也需考虑到制备探针的难易性和检测手段的灵敏性等其他因素。
目前，DNA探针已用于疟原虫、隐孢子虫、贾第虫、锥虫、巴贝斯虫、弓形虫、丝虫、血吸虫、棘球蚴、猪带绦虫、肝片吸虫和猪囊虫等虫种的鉴定和相应疾病的诊断上。
       3）常用核酸分子杂交技术：①Southern印迹杂交；②Northern印迹杂交；③斑点杂交( dotblotting)；④原位杂交(in situ hybridization)；⑤夹心杂交(三明治杂交)；⑥液相杂交。
       2．聚合酶链反应(即polymerase chain reaction，PCR)
       PCR是在引物介导下特异性扩增DNA的技术。它包括模板DNA热变性解链—引物与模板DNA退火—引物延伸3个步骤的循环过程。其基本原理是在实验条件下，根据温度的变化控制DNA解链和退火（引物与模板DNA结合），在引物启动和DNA聚合酶催化下，合成二引物特定区域内的DNA链。上述“解链—退火—延伸”3个连续步骤为一个循环。经过20 ～ 30个循环反应，可使引物特定区段的DNA量增加至少105倍。
       1）原理：
       PCR是模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP )在DNA聚合酶作用下发生酶促聚合反应，扩增出所需目的DNA。包括三个基本步骤：双链DNA模板加热变性成单链(变性)；在低温下引物与单链DNA互补配对(退火)；在适宜温度下TapDNA聚合酶催化引物沿着模板DNA延伸。
       2）PCR引物：
       PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性，引物设计决定PCR反应的成败。由于致病基因是在正常基因序列中发生点突变、片段插人和(或)缺失，基因两翼的DNA序列和正常基因仍然相同，因此根据基因两翼的DNA序列可设计出各20个碱基左右的一对引物。
       3）常用PCR技术：
       利用PCR技术，在适当条件下扩增目的基因，然后分析PCR产物，便可判断其是否为致病基因及其变异性质。此外，PCR具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速、样品处理简单等优点。反应过程可在PCR仪内自动进行，根据需要目前已衍行和发展出以下方法：①常规PCR；②复合PCR；③反转录PCR (RT-PCR)；④原位PCR；⑤反向PCR；⑥膜结合PCR；⑦彩色PCR；⑧定量PCR；⑨固着PCR；⑩免疫PCR。
目前，PCR技术多用于寄生虫病的基因诊断，分子流行病学研究和种株鉴定、分析等领域。已应用的虫种包括利什曼原虫、疟原虫、弓形虫、卡氏肺孢子虫、阿米巴、巴贝氏虫、旋毛虫、锥虫、隐孢子虫、贾第虫、猪带绦虫和丝虫等。
       3．生物芯片技术
       生物芯片技术是近年发展起来的分子生物学与微电子技术相结合的核酸分析检测技术。最初的生物芯片技术主要目标是用于DNA序列测定、基因表达谱鉴定和基因突变体检测和分析，所以又称为DNA芯片或基因芯片技术。由于目前这一技术已扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域，出现了蛋白质芯片、免疫芯片、细胞芯片、组织芯片等，所以改称生物芯片技术更符合发展趋势。