神经变性病的机制和防治的基础研究

1．氧化应激
氧化应激被认为是PD患者黑质神经元死亡的主要因素。DA在氧和水的存在下，受单胺氧化酶作用生成过氧化氢、醛和氨。过氧化氢可导致毒性自由基增加，于是诱发氧化应激反应。自由基对神经元的损害主要表现在如下几方面：细胞膜发生脂质过氧化反应，膜磷脂被破坏降解；细胞膜对钠，钙及大分子物质通透性增加，神经元发生细胞毒性水肿；线粒体破坏，功能丧失。
氧化应激在下列情况下会进一步加剧：? DA更新率（dopamine turnover）升高，引起过氧化物的过量产生；?谷胱苷肽（glutathione, GSH）缺乏，使脑内清除H2O2的能力降低；?活性铁离子增加，可加速OH×的形成。尸检研究表明，PD患者黑质部脂质过氧化和铁离子浓度明显增高，线粒体复合物Ⅰ活性降低，自由基水平增高，而某些抗氧化剂的水平降低，对蛋白质和DNA等产生氧化损伤，导致细胞能量－ATP缺乏而变性死亡。
2．兴奋性神经毒性
作为兴奋性氨基酸，谷氨酸主要通过其离子型的NMDA和AMPA 受体对DA能神经元产生影响。 NMDA受体多数存在于由皮质到纹状体的投射神经元中。而AMPA受体多存在于底丘脑核、苍白球内、外侧部等核团中。兴奋性神经毒性发生的机制是由于NMDA受体被活化后，引起了广泛的Ca2+内流以及Ca2+在线粒体内快速的堆积，导致线粒体功能丧失。 NMDA受体的兴奋还可增加一氧化氮合酶的活性，使NO合成增加导致神经细胞的毒性作用。此外，谷氨酸的毒性与引发PD的其他机制如线粒体DNA缺陷、过多的自由基形成和GSH (还原型谷胱甘肽) 耗竭等有关, 其中任一环节的失常都可引起神经元的损伤和死亡。
3．线粒体的损伤
线粒体是细胞能量产生的初级场所。毒性物质可以通过抑制线粒体复合物I来影响线粒体呼吸链导致ATP产生减少，最终导致细胞因能量耗竭而死亡。1-甲基-4苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP＋）也可以导致复合物I失电子，使其产生过氧化物。另外，通过对位于第18号染色体P11.3上编码复合酶I黄素蛋白区亚单位（它是与NADH发生作用的最主要的亚单位之一）的基因多态性分析发现，在PD病人这一基因的信号肽上发生了C-T置换，使得第29位上的丙氨酸变成了缬氨酸。据统计，带有这种突变基因的人发生PD的危险系数大大上升。
4．多巴胺转运体和囊泡转运体
对于多巴胺转运体(dopamine transporter, DAT) 和囊泡转运体(vesicular monoamine transporter，VMAT2) 在PD发病中作用的认识始于近几年。研究发现，DA在代谢过程中可以产生自由基等一系列毒性物质，通过DAT的介导造成了对DA能神经元的损伤。DAT位于神经元的细胞膜上，它可以将毒性物质转运到胞浆中从而对神经元构成损害，而VMAT2可以将位于胞浆中的这些毒性物质转运入囊泡中进而减少这些物质的毒性作用。两者相互配合来调节位于胞浆和囊泡中毒性物质的浓度。实验发现在DAT过表达的转基因小鼠，对MPTP毒性的易感性增高。而在通过基因敲除技术建立的只能表达半数的DAT的小鼠中，相同剂量的MPTP对其体内DA能神经元的毒性作用却下降了一半。将VMAT2的两个拷贝基因完全敲除，小鼠在出生后数天便死亡。只敲除单拷贝的基因并表达正常水平半数的VMAT2蛋白的小鼠能够存活，但用MPTP诱导的DA能神经元死亡的数量却增加了一倍。说明DAT和VMAT2的表达水平与DA神经元的死亡有直接的关系。
5．神经营养因子缺乏
神经元和胶质细胞能够合成、分泌大量的神经营养因子，诸如神经生长因子（NGF）、睫状神经营养因子（CNTF）、脑源性神经营养因子（BDNF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）。这些神经营养因子对于神经元的存活和神经突起的生长具有重要作用。在各种损伤情况下，神经营养因子均出现上调。离体和在体实验均证明BDNF、GDNF和CNTF对MPTP造成的DA能神经元损伤具有很强的保护作用，而在PD病人，黑质部位的NGF、 BDNF和GDNF的含量均明显降低。提示神经营养因子的降低可能促进PD的发生或进展。因此，补充外源性神经营养因子或促进内源性神经营养因子的表达，如基因治疗一直是该领域研究的热点。
6．免疫功能异常
免疫系统异常可能参与PD的发病是Abramsky等于1978年首先提出的。多年的研究已证明，PD病人的确存在免疫系统功能异常，而免疫反应异常可能在PD的发病和发展过程中又起着重要的作用。现在，免疫系统已成为PD发病机制研究的又一热点。
许多研究发现，PD患者伴有细胞免疫和体液免疫功能异常。Fiszer等发现PD病人的CD4+ T细胞减少，IL-1水平降低，血清IgM和IgA水平下降。新近的研究也发现辅助T细胞和B细胞大量减少。研究还发现，单侧纹状体和中脑DA能神经元损伤可诱发免疫反应。其它如神经毒物、代谢紊乱、抗PD药物等也会影响免疫系统功能。
现已明确小胶质细胞和细胞因子参与了中枢神经系统损伤后的细胞反应。McGeer等的研究发现PD病人的黑质致密部存在大量HLA-DR阳性小胶质细胞，远远高于对照组病人，特别是在DA神经元退变最为严重的区域，如SNc的腹部和侧部变化尤为明显。有研究显示，用PD患者的血清纯化得到IgG后，注入成年大鼠的黑质，4周后发现注射侧酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性细胞数较对照组降低50%，黑质损伤部位的小胶质细胞浸润明显。在前脑内侧束切断的PD大鼠模型，也发现了异常激活的小胶质细胞。
在PD患者的脑脊液发现了DA能神经元的抗体，PD患者的脑脊液能抑制培养的DA能神经元的生长。PD病人的血清也对大鼠中脑DA能神经元具有补体依赖的细胞毒作用。另外在PD病人的纹状体区域β2微球蛋白含量与对照组相比明显升高，MHC-I在此部位表达上调，皮层则无此变化。将DA能神经元的杂交株产生的抗体注入大鼠脑内，可建立PD的免疫模型。模型鼠表现少动症状和大量的SNc神经元缺失，提示免疫成分异常可直接导致DA神经元的死亡。
PD患者脑内最为明显的变化是细胞因子的大量增加。Mogi等报道，PD病人的纹状体和脑脊液中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的含量较正常组增加760-1570%；同时TGF-α、TGF-β1、TGF-β和bcl-2的表达上调。其它实验室也有类似发现。同时，TNF-α受体R1也出现上调，可能进一步放大TNF-α的毒性作用。有研究表明，给予动物DA能神经毒素6-OHDA和MPTP，也可使黑质—纹状体的细胞因子水平明显升高。TNF-a以及诱导TNF-a产生的因素，如LPS等可直接引起DA神经元的死亡。PD病人的脑脊液也可引起体外培养的DA能神经元的死亡。这些结果提示过量的细胞因子可能参与了DA神经元的变性坏死过程。
目前的研究还不能证明免疫异常和PD发病孰因孰果，其变化的机理也不完全明了，可能与神经—免疫—内分泌调节障碍(如雌激素水平降低与甲状腺功能减退等)和胶质细胞异常活化、增生，多种细胞因子和自由基生成过多等因素有关。此外，有研究表明免疫炎症反应和细胞凋亡在PD 的发病中也起着一定的作用。
7．神经肽异常
锥体外系统的神经传递功能除了与DA和ACh两大系统有关外，还存在有多种肽能神经元的活性。在80年代中，曾有人先后报道了PD患者脑苍白球和黑质中P物质水平下降30％－40％。在壳核和黑质中两种脑啡肽[甲硫氨酸脑啡肽（MEK）和亮氨酸脑啡肽（LEK）]含量都分别减少50％－70％。胆囊收缩素（CCK－8）在黑质中下降30％。神经降压肽（NT）在下丘脑和海马区含量也下降。用3H标记的D－Ala－MEK研究纹状体MEK受体数量减少。这些实验结果提示多肽水平的变化与PD的发病机理可能有一定的联系。但也有人认为是继发于锥体外系统广泛神经元变性的后果。
8．蛋白质异常修饰和错误折叠
近年来，蛋白质的异常修饰和错误折叠在神经系统退行性疾病的发病中的作用越来越受到关注，被认为可能是神经细胞变性死亡的关键环节。在PD发病中，某些关键蛋白质发生的异常修饰扮演着重要角色，如酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）发生了异常磷酸化，a-Synuclein发生了异常硝基化、磷酸化。蛋白质的硝基化可能是PD等引起的神经元损伤的病理机制之一。在PD患者脑内Lewy小体中，存在大量酪氨酸硝基化的a-Synuclein；硝基化的a-Synuclein易形成聚合体；毒性物质6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）处理的a-Synuclein易产生硝基化；神经毒素MPTP可导致PD小鼠的纹状体和中脑腹侧的a-Synuclein发生硝基化。6-OHDA和MPTP还能够引起DA合成的关键酶TH硝基化，从而导致酶活性丧失。
大量蛋白质尤其是与细胞生长、存活、凋亡密切相关的蛋白质普遍存在化学修饰（如糖基化、磷酸化、羰基化、硝基化等）；这些化学修饰不但能够改变蛋白质的立体结构，而且是实施功能与调节的重要结构基础。蛋白质的硝基化多发生于酪氨酸，体内3－硝基化酪氨酸的水平，被认为是衡量蛋白质体内硝基化的指标。这种蛋白质翻译后修饰被认为是不可逆的。蛋白质的硝基化可以引起蛋白质原有的功能改变，如锰超氧化物歧化酶、谷氨酸合成酶的蛋白质硝基化，会引起酶活性丧失；蛋白质的硝基化也可以使蛋白质获得异常功能，如影响酪氨酸磷酸化参与的神经元信号转导过程。目前，这些酪氨酸硝基化的位点、硝基化蛋白的功能改变以及在神经变性病所致神经元损伤中的作用机制等问题尚不清楚。一般认为，这些蛋白质异常修饰的分子机制、异常修饰对自身结构与功能的影响、对相关蛋白相互作用的影响、对神经元功能结构的影响以及是否存在其它具有重要作用的被异常修饰的蛋白质等，是神经变性病基础研究的难点和热点。
除了异常修饰，蛋白质的错误折叠在神经元变性死亡过程中的作用也同样受到关注，成为神经系统退行性疾病发病机制新的研究方向。蛋白质的折叠和错误折叠是生命科学中的基本问题。肽链的折叠是蛋白质获得生物学功能基本环节之一。一个基因通过转录、翻译获得了完整一级序列的蛋白质后，还需要折叠成为具有正确的空间结构的分子才能恰当行使其功能。因此，蛋白质的折叠机制成为在过去30年中生命科学界共同关注的课题。迄今，生物学界主要通过X-ray、核磁共振（neclear magnetic resonance, NMR）等手段研究蛋白质的空间结构，从而了解蛋白质的结构与功能。但是，一条多肽链是如何折叠成为具有生物学功能的结构，特别是细胞内的折叠过程，蛋白质分子的内部结构是如何形成的，以及与微环境影响因素之间的相互作用等尚不清楚。另一方面，肽链的错误折叠将导致蛋白质功能的丧失，从而影响相关代谢途径的功能失调。PD患者脑中出现Lewy小体等都与蛋白质错误折叠形成的产物密切相关。特别是a-Synuclein等是PD病变常见错误折叠和积聚的重要蛋白质分子。2004年，Peter & Niels认为“蛋白质构象病”主要是由于细胞内蛋白质折叠调控系统失调所致，包括由于基因突变、异常修饰、微环境改变、分子伴侣功能失调等。蛋白质错误折叠可能形成不同的状态，即“稳定错误折叠状态”、“非稳定错误折叠状态”以及“聚集倾向状态”等。不同的错误折叠状态对细胞功能的影响不同。蛋白质错误折叠是神经变性病发病过程中的共同特性，许多神经系统的疾病在细胞水平，可以归结到多肽链折叠机制的失调和错误折叠的蛋白质在细胞内的聚积。但是，蛋白质错误折叠的分子机制目前并不清楚，特别是对细胞内蛋白质错误折叠的机制以及蛋白质聚积物是如何导致神经元死亡的机理、作用环节以及相关基因功能失调等尚不认识。PD中TH或a-Synuclein等关键蛋白如何发生了错误折叠，从而导致疾病还不清楚，需要解决的问题包括：1）诱导蛋白质错误折叠的因素；2）蛋白质错误折叠的分子机制；3）错误折叠的蛋白质是如何导致细胞功能失调和死亡的机制；4）防止蛋白质错误折叠的方法和手段等。上述每种学说均难以圆满解释所有PD病例的病因及发病机制，对于某一患者可能有多种机制参与。值得注意的是上述学说之间是相互联系、相互影响的，比如：MPTP、Glu、细胞因子和自由基均可引起细胞凋亡；MPTP、6-OHDA可诱导TNF-a和IL-1b的过度生成；凋亡的细胞也对细胞因子的产生有刺激作用；遗传变异可增加机体对MPTP等毒素的敏感性；氧化应激不仅能够破坏线粒体的功能，而且也能导致蛋白质的异常表达和聚积；线粒体功能缺陷可由某些毒素（外源性和内源性）引起，并进而导致氧化应激增强和蛋白质的过表达和聚积；基因突变本身既可导致蛋白质异常聚积，并成为家族遗传性神经变性病的启动因素，同时蛋白质的过表达和聚积也可导致氧化应激和线粒体功能异常。因此，上述因素之间可能相互作用从而形成一种恶性循环，不断放大损害效应，在此基础上激活小胶质细胞和启动炎症反应，最终形成进行性神经元变性死亡。因此，PD的发病可能是多个致病因素共同作用的结果。其中，蛋白质异常表达、修饰和错误折叠的机制及其与神经细胞功能紊乱之间的相互作用关系，可能成为神经细胞变性死亡的关键环节。2005年，由多名国内长期从事神经退行性疾病研究的科研人员组成的研究团队，针对包括PD在内的神经系统退行性疾病将进行一系列深入研究，并已经获得了5年期的国家“973”计划项目资助。课题研究的关键科学问题即：特定蛋白质的异常修饰、错误折叠与神经细胞功能紊乱及它们之间的相互作用是神经细胞变性死亡的核心机制，同时包括蛋白质异常的遗传学原因、针对特定蛋白的早期诊断标记物寻找和干预治疗手段的开发等多项研究，期望能够对PD的发病机制有更加深入的认识，从而为疾病的诊断和治疗奠定基础。