PCR注意事项

来源：百度文库编辑：神马文学网时间：2024/04/28 21:37:52

1．5．1 PCR的操作注意事项
◆模板：
PCR所用的模板一般稀释至纳克数量级，并保存于-20。C。闭环DNA模板的扩增效率略低于线性DNA。当使用高分子量的DNA（>10kb）作模板时，如用限制性内切酶先行消解（靶序列中没有此酶切位点），则扩增效率更好。
PCR所用的模板一般使用量为：
哺乳动物基因组DNA  1.0ug DNA。
酵母                1~10ng
细菌                10ng~100ng
质粒                0.1ng~10ng
◆引物：
标准PCR反应（不限制引物数量）每条引物的典型浓度时0.1~0.5umol/L（即6×1012~3×1013个分子）。该浓度扩增1kbDNA片段少于30个循环的PCR反应绰绰有余，更高浓度的引物可能引起错配，导致非特异性扩增。
买来的引物应先离心几秒钟后，加入一定量的TE至引物浓度为40μM，保存于－20。C。
使用时，稀释成20uM，避免反复冻融。
◆dNTP：
在MgCl2  1.5mmol/L条件下，每种dNTP的浓度一般在200~250umol/L之间。
高浓度dNTP（>4mmol/L）对扩增反应起抑制作用。因为dNTP与Mg2+螯合而引起。如扩增片段在约1kb长度。每种dNTP浓度控制在20 umol/L至0.5~1.0pmd/L，可能会使扩增产物获得满意产率。
普通PCR用的dNTP浓度为2.5mM，保存于-20。C避免反复冻融。
在-20。C长期保存的dNTP少量水分会蒸发，然后凝结在管壁上，因此使用前要离心几秒钟。
◆Mg2+：
通常缓冲液中Mg2+最佳浓度时1.5mmol/L。
适当增加Mg2+浓度可以减少非特异性引导。
◆DNA聚合酶：常规PCR。 rTaqE每个标准的25~50ul反应体系用0.5~2.5单位。

PCR注意事项请教quantitative real-time PCR技术的具体操作步骤和注意事项-PC... TS PCR TAIL-PCR(Termal Asymmetric Interlaced PCR) PCR的物理意义 PCR的物理意义关于Touchdown PCR SiteFinding-PCR啊 PCR引物的相关问题 PCR引物的相关问题蝴蝶兰病毒的PCR 引物注意事项注意事项注意事项注意事项数字电视复用器中的PCR校正技术1 数字电视复用器中的PCR校正技术一 PCR产物电泳时间及结果分析pCR产物的电泳检测时间荧光定量PCR仪选择误区和要点分析 - PCR仪 - 易生物各款荧光定量PCR仪的性能比较 PCR的工作原理 - chenliangming的专栏 - CSDN博客 Blackburn:Yeast Colony PCR v2.0 protocol - Op... 经期注意事项月子注意事项重装系统注意事项