重庆啤酒：当神话成为现实之时(多表)

　　乙肝疫苗的国内外现有研究，除多肽类疫苗是在表位识别水平外，其余的都是在蛋白大分子水平上。此外，无论是蛋白疫苗、DNA疫苗还是多肽类疫苗，都是集中在天然抗原选择搭配，难以克服天然抗原的免疫弱势和蛋白大分子的免疫偏差和免疫颠覆，同时也没有取得治愈的突破性进展。

　　吴玉章首创了表位识别的氨基酸密码学说和模拟抗原的分子设计理念，来克服天然抗原的免疫弱势和蛋白大分子的免疫偏差和免疫颠覆。该学说和理念在乙肝项目的实践和试验中得到了验证。该项目临床前期的相关实验效果很好。

　　通过对乙肝免疫耐受的机理、相关免疫识别理论（表位生物学、氨基酸密码学说）、免疫信号传递和免疫效应执行有关的Th1/Th2细胞极化、Th1/Th2细胞极化与CTL效应的关系、CTL免疫识别和效应、基于表位的疫苗设计路线（EBVD）、治疗用（合成肽）乙肝疫苗的设计和实验情况等相关内容的研究。我们认为该疫苗的设计路线新颖，理论可靠性高，具有很高的实用价值，能够打破乙肝免疫耐受，彻底清除乙肝病毒。

　　吴教授提出的氨基酸密码学说和模拟抗原分子设计理论，除乙肝之外，还对免疫系统出现偏差的许多疾病都是可以应用的。因此该技术还有很多的应用前景。例如：糖尿病、肿瘤等与免疫系统不作为有关的疾病。

　　预计06年的EPS约为0.45元（股改前股本），鉴于治疗性乙肝疫苗发展空间，和相关技术的广阔应用前景，以及进入疗效检测的关键时期，我们建议投资者在合理的风险承受范围内，买入该公司股票。

    一：啤酒行业概况众所周知，啤酒是世界上产销量最大的酒类饮料。近年来，中国居民的饮酒习惯正在发生深刻的改变，传统的白酒（尤其是低端白酒）日渐淡出，啤酒已经占据国内酒类市场的半壁江山。改革开放二十多年来中国啤酒工业迅猛发展，从1987年到1994年国内啤酒年产量均增幅在20%以上，最高时达到30%以上，1995年以来我国啤酒产量增长速度放慢，但年均增幅仍达到7%以上。啤酒行业已成为中国酿酒业中发展最快、规模最大的子行业。目前我国啤酒行业在经历了激烈的市场竞争和行业整合后,产业集中度发生了很大变化,企业数量从上世纪90年代的900户减少到500户左右,2005年前10名企业就占了61%的份额。经过近十年的兼并整合，龙头企业的市场占有率逐年提高，我国啤酒业集中度得到了进一步的提高，进入了区域寡头垄断时代。

     2004年中国人均啤酒消费量21.5公升，中国消费总量达2870万吨。经历了去年的“甲醛风波”后，中国啤酒年产量仍然达到３１８９万吨，实现连续４年稳居世界第一，成为名副其实的啤酒生产大国。到２００５年年底，中国年人均消费啤酒已达24.4升，接近世界平均水平的26升，但和啤酒发达国家动辄上百升的人均消费量相比，还有很大的发展潜力。到今年５月底，中国已产销啤酒1240.76万吨，同比增长15.4％，好于往年。而６～１０月正是啤酒旺季，今年对中国啤酒产业而言又是一个丰收年。

    近几年来，我国啤酒行业正在逐渐告别恶性竞争时代，行业集中度逐年提高，行业尤其是行业龙头企业的发展面临较好机遇。预计未来几年内，我国啤酒市场将继续保持年均5～8％的成长速度，大大高于欧美等国家成熟啤酒市场的年均约1％～2％的成长速度，继续成为世界上最具吸引力和最具潜力的啤酒市场。而重庆啤酒作为我国啤酒第二方阵的领军企业，预计其将继续获得比行业更高的成长性。

　　二：公司啤酒业务分析1．公司啤酒业务的现状国家经贸委负责人曾以“北有燕京、南有珠江、东有青岛、西有重啤“来肯定重啤在全国同行业中的重要地位。1993年5月25日，重庆啤酒集团将下属的核心企业——重庆啤酒厂改组，发起设立了重庆啤酒股份有限公司，1997年10月在上海交易所上市，重庆啤酒股份公司也因之承继了公司的大部分啤酒主营并成为集团公司在啤酒领域的旗舰。目前集团公司拥有24家公司，生产能力突破280万吨。

　　经过近几年的扩张和整合，公司啤酒业务进入了收获期。为公司啤酒业务走向全国奠定了很好的基础。公司主营啤酒业务近几年保持良好的发展态势，主营收入呈现快速发展态势，从1999年～2004年五年间公司主营收入平均复合增长率达到32.60％，其中近三年平均复合增长率更是高达38.90％，公司主营收入的高速增长主要是因为公司近几年来为了拓展其啤酒业务的未来发展空间，在稳固重庆本地市场的基础上，加大了对外地市场的扩张力度，最近一次收购完成后，公司的啤酒产能已超过100万吨/年，基本上能够满足现有市场的需要。虽然还不能与青岛啤酒和燕京啤酒等行业第一集团军的规模相比，但作为地域品牌，重庆啤酒的规模劣势已经大大降低，具备了较强的抗风险能力和进一步扩张的潜力。

　　公司在２００２年至２００５年啤酒产量以每年３０％左右的幅度增长，而净利润则始终保持与规模同步增长，直到今年上半年加速增长，公司啤酒业务06年的二季度产量增长了20％，收入增加了30％，利润增长了35％。半年度的业绩增长达到50%以上。。纵观国内啤酒行业的扩张，大多数是规模扩张的同时效益会不同程度受到影响。“重啤式扩张效应”实属难得。公司06年上市公司的产量将会达到100万吨左右，集团有280万吨的产能。公司产品的市场占有率为：（1）、西南市场：公司产品市场占有率约45%，其中重庆市场占有率达80%以上，四川市场占有率达20%以上。（2）在华东一带的江苏市场占有率达30％以上，浙江市场占有率达15%以上，安徽市场占有率达30%以上。（3）华中市场：公司产品市场占有率约10%。公司已经从区域性啤酒企业向全国性啤酒企业的发展方向上迈出了较大的一步。

    从公司上市以来的业绩数据可以看出公司啤酒业务的发展轨迹，在2000年到2003年的扩张期间，除了01年以外，公司的主营收入、净利润同步出现增长。特别是在04年和05年公司扩张后的整合效果开始体现，净利润的增长开始追上主营收入的增长速度。公司啤酒业务06年的二季度产量增长了20％，收入增加了30％，利润增长了35％。06年净利润的增长已经超过主营收入增长率。显示公司啤酒业务的良好发展趋势。

　　2．公司啤酒业务的发展前景啤酒行业在基本完成一轮并购和整合之后，国内大型啤酒企业已经具有了提高品牌竞争力所必须的规模优势。这仅仅是一个必要条件，面对来势汹汹的国际巨头，国内企业必须借鉴国内外先进经验，建立和完善中国现代化的酿造装备行业技术创新体系装备制造和管理创新体系，以适应啤酒工业向产业化方向健康发展的需要。所以，各啤酒企业在迎接国际巨头和业内同行的竞争过程中，细节将会决定成败。从下面的主要上市公司吨酒收入和吨酒利润的图表中，我们可以看出，公司的吨酒收入02年到05年分别是2096.12元、2124.76元、2063.68元、2074.55元。而同期的青岛啤酒要略胜于重庆啤酒基本上维持在2400元左右。燕京啤酒的吨酒收入维持在1700元左右。惠泉啤酒的吨酒收入维持在2100元左右，但是05年它的吨酒收入下降到了2000元一下。在吨酒的主营利润方面，重庆啤酒的优势开始有所扩大，公司近四年的吨酒平均主营利润为736.80元，分别高于燕京啤酒和惠泉啤酒的448.15元、422.42元。与青岛啤酒的752.73元比较接近。同时我们单看05年重庆啤酒是679.68元，而燕啤、青啤、惠泉分别为474元、767元、374元。

　　而吨酒的净利润方面重啤以115.85元高居榜首，其次是燕啤的108元、青啤的78.54、惠泉的73.85元。而在05年他们分别是109元、97元、76元、63元。从吨酒的收入和利润比较来说，公司在行业内还是具有很强的竞争力。

    在吨酒费用方面，重庆啤酒的财务费用相对较高，近四年的平均值为66.24元。

　　燕啤、青啤、惠泉分别为9.41元、24.90元、43.27元。营业费用方面，重庆啤酒近四年的平均值为320.10元。燕啤、青啤、惠泉分别为150.77元、400.67元、151.41元。管理费用方面，重庆啤酒近四年的平均值为209.12元。燕啤、青啤、惠泉分别为158.57元、196.99元、113。47元。在看到平均值之后，我们注意到，虽然重庆啤酒的吨酒三项费用较高，但是他的趋势是在逐步降低。而其他的三家企业它们是处于一个上升的趋势。同时应该注意到重庆啤酒在市场不断扩张中，费用是逐年的下降。说明公司的管理绩效在不断的提高。06年公司业绩出现的大幅增长，从一个侧面印证了我们的分析。

    虽然公司吨酒收入和费用指标都是相对处于劣势，但是公司的吨酒利润却是最好的。说明公司在原料成本的控制，生产工艺的优化和产品结构的调整方面是这几家公司中最好的，符合目前啤酒工业的发展趋势，即技术创新和管理创新的企业将会在行业竞争中胜出。通过公司吨酒收入、利润和费用与同行业相比，可以看出，公司的啤酒业务处于一个良好的发展趋势。重庆啤酒，在完成了在西南地区的战略布局后。一举拿下湖南、江苏、浙江等地三家较大规模的啤酒厂；接着涉足华南、中原、华北市场。目前，重庆啤酒已经形成西南、湖南、浙江、江苏等几大利润中心。公司已经突破了区域性企业的地位，具备了与全国性啤酒企业竞争的实力。06年公司啤酒业务收入与利润的高增长，预示着未来公司啤酒业务的将进入一个快速发展期。

    公司生物产业分析前期报告，我们介绍了公司生物产业的发展历史和现状，以及治疗性乙肝疫苗的相关情况。由于公司的合成肽治疗性乙肝疫苗项目进入关键的临床二期，我们认为有必要就大家最为关心的治疗性乙肝疫苗项目进行更为细化的分析。

　　以下资料主要来源于有关乙肝疫苗相关的研究文献，吴玉章、边疆两位教授"等人"公开发表的相关研究文献。本部分的一些结论是本人通过研究原始文献得出的。

　　投资者可以通过研究原始资料得到自己的结论。

　　1．治疗性乙肝疫苗的研究进展目前治疗性疫苗，是指能够打破慢性感染者体内免疫耐受、重建和增强免疫应答的新型疫苗，是抗病毒、抗肿瘤的新型免疫手段。在现阶段，关于乙肝病毒免疫耐受的机理，欧洲学派认为是树突状细胞不作为，而美国学派认为是T细胞不作为。

　　目前在这两个方向都有人探索治疗性乙肝疫苗。由于CTL(细胞毒性T细胞)和Th1细胞和相关的细胞因子是清除细胞内病毒的主要手段，所以有学者集中在提高细胞免疫方面做出了探讨。

　　从治疗性乙肝疫苗种类来说，目前主要分为蛋白疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗这几大类。

　　蛋白疫苗：大家都是集中在HBsAg作为基础抗原，通过重组或者改变抗原提呈方式。以期达到打破机体免疫耐受的目的。由于对乙肝病毒的研究发现，preS蛋白上具有肝细胞的结合序列和Th（辅助性T细胞）表位能够增强该蛋白的免疫原性。

　　对提高免疫应答率和打破免疫耐受有积极作用。Senturk等利用含有preS、CHO细胞来源的M蛋白组成的GenHevac B疫苗，能够诱导机体产生抗preS2抗体和抗S抗体，并降低部分慢性乙肝患者血清中的DNA拷贝数，表明GenHevac B疫苗在预防方面优于目前的S蛋白预防性疫苗，但是该疫苗不能够有效的降低免疫耐受患者血清中的病毒DNA拷贝数。而且无清除或者降低肝细胞内cccDNA(共价闭合环状DNA)含量的证据。

　　Page M等利用含S(aywz和adw)、preS2-S(preS1 20-47aa ayw+S adw)4种成分的新型多分子疫苗Hepacare。该疫苗的免疫原性更强，在小鼠、大猩猩和人体内都能够激发强烈的体液和细胞应答，该疫苗在慢性乙肝患者体内激发的主要以Th2z细胞因子为主，特异性的CD8+T细胞增殖并不明显，虽然能够抑制病毒复制，但是CTLs活性低，依旧不能够清除肝细胞内cccDNA。治疗作用不是很理想[4,5,6]。所以增加preS成分的疫苗虽然提高了机体的免疫应答，但是只是增强了预防效果，对于作为治疗性疫苗还是远远不够的。

　　闻玉梅等研制的抗原抗体复合物疫苗是通过抗-HBs与HBsAg混合后，增强HBsAg的提呈来诱导免疫应答，消除免疫耐受。目前临床Ⅱ期试验基本结束，没有有关治愈的报道。

　　DNA疫苗：DNA疫苗主要是通过表达质粒载体，持续表达抗原蛋白，反复刺激免疫系统。1990年，wolff通过试验证实了外源基因在体内的转染和表达，为DNA疫苗的运用奠定了基础。Davis等通过给小鼠肌肉注射表达HBsAg的DNA质粒，可以诱导小鼠能够产生体液免疫和细胞免疫。4－8周出现高滴度的抗-HBs，高水平的CTL和CTL前体细胞在1周内能够被检测到，并维持数月之久[7,8]。MegedeJZ等通过同义突变优化抗原基因，提高了疫苗的表达量，激发了更强烈的体液和细胞免疫反应。DNA疫苗通过优化后可以达到治疗性疫苗的要求。激发高水平的CTL应答。

　　DNA疫苗免疫效果与质粒表达抗原的性质、水平和方式都有很大的关系。另外，进入体内的质粒是不可控的，它持续地在人体内表达抗原，一旦出现免疫偏差，后果非常严重，所以对人体的长期副作用还是无法评价的，DNA疫苗的安全性问题非常大。

　　多肽疫苗：多肽类疫苗的理论基础是基于抗原分子表为水平的研究。由于蛋白质抗原是通过表位来体现其免疫特异性，有效的保护性免疫有赖于一组抗原表位的合理搭配和组合（在吴玉章的多肽疫苗中详细论述）多肽疫苗去除了抗原蛋白重的无效序列和免疫抑制序列。剩下的是免疫有效成分，具有高效、针对性强、副作用低的特点。由于表位的锚基序、侧翼序列影响表位的亲和力和切割提呈效率。因此，在表位优化及组合、链接方式等研究积累后，多表位多肽疫苗完全可以实现高提呈效率和应答类型的可控。目前多肽类疫苗的关键在于期免疫原性太弱。但是可以通过糖基化、脂质修饰和辅以适当的佐剂来克服。Vitiello A等用CY-1899T细胞疫苗，治疗慢性乙肝患者。该疫苗是T细胞相关表位疫苗。该疫苗包括源于核心抗原（HBcAg）第18～27位的氨基酸组成的CTL表位，源于破伤风类毒素的T辅助性细胞（Th）表位和两个棕榈酸分子。在26位健康志愿者中进行的剂量梯度实验显示出良好的安全性，并且可以诱导核心抗原的CTL反应。在19例慢性乙肝患者注射该疫苗后，诱导的CTL反应只有在健康者体内的十分之一，随访中没有发现肝脏生化指标或病毒学的显著变化。也没有发现严重不良事件[10,11]。吴玉章等研制的TT830-843(破伤风类毒素的T辅助性细胞表位)、HBcAg18-27 CTL细胞表位、PreS218-24的B细胞表位、以及棕榈酸作为分子内佐剂，和相关表位的定位后的组成的MAP(multi-antigen peptide)已经开始临床二期。预计不久的将来人们将会看到该疫苗的治愈效果。

　　小结：

　　目前，无论是蛋白疫苗、DNA疫苗还是多肽类疫苗，国内外现有研究开发，主要集中在天然抗原选择搭配、在预防性疫苗的制剂中添加抗原或抗体的方式。而且除多肽类疫苗是在表位识别水平外，其余的都是在蛋白大分子水平上。目前所有的治疗性乙肝疫苗没有出现有效治愈的案例，没有取得突破性的进展。吴玉章首创了表位识别的氨基酸密码学说和模拟抗原的分子设计理念（我们在下面会详细介绍），来克服天然抗原的免疫弱势和蛋白大分子的免疫偏差和免疫颠覆。2．治疗用（合成肽）乙肝疫苗的理论基础乙肝的感染和自愈自然痊愈的机制是慢性乙肝患者的免疫力增强，提高了Th1细胞活化比率，产生足够强的细胞免疫反应，彻底清除病毒。虽然，慢性乙肝患者的免疫力弱化，但是由于存在极少数患者通过自身免疫的增强打破了免疫耐受，为在理论上能够彻底清除病毒提供了基础。目前国内外，在这方面的研究探讨非常多，希望通过增强慢性乙肝患者的免疫系统的免疫力，纠正免疫系统的不作为，但是没有取得良好的效果。

　　乙肝病毒进入人体后，分为感染急性期和感染慢性期。在感染的急性期，B细胞和T细胞合作共同将病毒杀灭。其中B细胞接受抗原提呈细胞（APC）传递的信号，开始分泌抗体，最初分泌IgM型抗体，后为IgG型抗体（主要是IgG2a）。产生的抗体与相关抗原结合后将抗原抗体复合物通过巨噬细胞和抗原提呈细胞将信号向下传递。这就是体液免疫。而免疫系统最终清除病毒的手段是细胞免疫。在急性感染期(a)、Th1细胞大量繁殖以清除病毒，(b)、Th2细胞适量增殖。

　　当进入感染慢性期，Th2途径调控下的Th1细胞相关的免疫反应低下，不能杀死所有的肝炎病毒，使得病毒的产生和清除处于平衡状态，此时血清中的肝炎病毒滴度和肝细胞感染指标长期存在，病人进入了慢性肝炎期。所以，Th1/ Th2细胞活化的失衡导致Th1细胞、和CTL细胞的功能低下，不能够清除感染病毒的肝细胞，从而机体表现为持续感染状态。

　　免疫力强的患者，通过感染急性期后，能够自己痊愈。免疫力弱的患者进入感染慢性期后，自愈的概率在1％以下，基本上是认为不可治愈。

　　乙肝病人的免疫耐受免疫耐受是乙肝慢性化的主要原因之一，表面抗原为分泌性蛋白，在慢性感染者体内，它作为耐受原清除了血清中的活化Th1细胞，使得患者的细胞免疫强度不高。同时表面抗原的变异也是目前乙肝难以治愈的因素之一。如何在体内启动Th1细胞极化和有效的细胞免疫，来克服免疫耐受成为关键问题。

　　目前在天然抗原的组合和搭配上进行了多年的探索，依然是没有取得突破性的近展。主要是由于天然抗原产生的免疫耐受、免疫偏差、免疫颠覆基本上是同时存在，因此仅仅依靠天然抗原的组合难以解决乙肝病人的免疫耐受。

　　免疫识别的新理论（表位生物学、氨基酸密码学说）

　　表位生物学：目前研究表明，蛋白质抗原不是通过它的完整分子来发挥功能（与信号传递和转导的机理非常类似）。它的特异性是通过其表位来体现的。一个蛋白质抗原，它含有多种与免疫识别密切相关的表位例如：B细胞表位、Th细胞表位、CTL细胞表位等与免疫识别密切相关的结构，而且还同时存在毒性或抑制性表位、优势非中和性表位、病理与自身抗原交叉反应性表位等与保护性免疫不利的成分。

　　人们还认识到在同一蛋白质分子的众多表位中，各表位对抗原性的贡献不同，有优势表位和非优势表位之分。此外，表位间的相对位置、构像特征、表位侧翼序列等也与表位功能的表达密切相关。

　　许多研究发现，天然蛋白抗原在激发免疫反应时，不能够满足清除病原体的需要，主要是由于隐匿的保护性表位功能未能够表达。因而所引发的保护性免疫不够强大。二是所引发的免疫反应发生了免疫偏差（deviation），甚至造成T、B细胞之间、T细胞亚群之间互相残杀，从而加重感染。因此，对于抗原性的研究需要从天然抗原整个分子水平向表位水平过渡。进入表位水平后，同一表位内氨基酸残基对抗原性的贡献也不同，此外表位内氨基酸的组成和顺序决定了抗原的特异性。现代保护性免疫理论认为：有效的保护性免疫来源于一组表位的合理组合与搭配。

　　免疫原由天然蛋白大分子向亚单位、表位多肽水平过渡后，分子量变小了，所引发的免疫应答的特异性和针对性增强了。并且摆脱了抑制性和毒性表位的影响。在分子量减小和特异性增强的同时，也产生出新的问题。一是分子量减小，造成抗原性和免疫原性的降低，从而不能激发满意的保护性免疫反应。二是修改和重新搭配后的表位所组成的短肽分子能否在体内得到正确的呈递？

　　通过国际上许多实验室通过对上千种不同抗原进行的免疫识别研究，积累了丰富的表位研究资料。关于提高免疫原性，目前形成了两条思路。1、恢复短肽分子的生物大分子的特性。通过采用多分枝抗原系统、融合蛋白设计等。2、设计更有效的免疫原分子。如脂质肽分子、T、B细胞表位或多表位嵌合体、分子内佐剂疫苗的设计等。

　　有关短肽分子能否在体内得到正确呈递的问题，近年来也引起了许多实验室的关注。抗原呈递的研究进展很快，除了有MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类似物呈递途径外，还有CD1呈递和直接呈递等多种方式。从传统的表位概念来看，CD1呈递和直接呈递尚缺乏寻找表位的方法。另外，单纯的多肽抗原在体外能有效的激活CTL细胞，但在体内则无此反应。据文献报道，加入脂类基团能够有希望解决这一问题。

　　氨基酸密码学说：吴玉章根据实验发现和理论推算，提出了免疫识别过程中蛋白质抗原以其氨基酸残基的组合和搭配而形成“识别码”的学说。认为蛋白质的抗原性主要由其侧链组合形式决定，推断识别码的大小约为15个氨基酸。该学说对指导今后的免疫识别研究和新型疫苗设计具有指导意义。

　　该学说的主要观点：1、蛋白质抗原性由组成蛋白质的氨基酸顺序所决定。2、氨基酸顺序本质上是氨基酸侧链的排列和组合方式。因为多肽链的主链结构都是相同的，侧链的组合方式直接决定了肽链的亲（疏）水性、带电情况、可及性、动性及空间构像等，这些特征与蛋白质的抗原性有关，属于间接相关。3、由氨基酸残基组成的“识别码”在顺序上应是宿主自身分子所没有的，以保证区分“自我”与“非我”而不引发自身免疫反应。4、为构成有效的“识别码”，蛋白质抗原不受自然氨基酸顺序限制，即可以有交叠顺序或间断顺序通过肽链折叠形成。5、不同的氨基酸残基在抗原识别过程中可能有相同的贡献。有可能根据氨基酸残基的抗原性进行分类。6、有效区分“自我”、“非我”的识别码大小是15个氨基酸残基。

　　大于15个残基的识别码引发高动力型免疫应答；小于15个残基的识别码原则上只引发低张力“联系”，且残基数越少张力越低，引发自身反应的可能性越大。7、根据抗原性分类的氨基酸残基是形成识别码的基本密码。8、识别码免疫原性的表达还有赖于其所处分子内的环境，如B细胞表位、T细胞表位、MHC限制位间的相对位置及其间隔顺序等。

　　在文献中，有关该学说的提出进行了详尽的论述，主要思想是根据20种氨基酸的抗原指数，以及氨基酸的理化性质和抗原表位相关的统计，抗原抗体结合的分子机理，相关试验数据和经验，提出了该学说，该学说在吴教授的研究中也得到了实践的验证。疫苗设计的基础和方法从Jenner开始，研制疫苗就是模拟天然感染过程，对于预防性疫苗已经取得了很大的成功，为人类抵抗感染性疾病做出了重大贡献。近来的研究表明模拟自然感染过程的策略，往往不能够制备出高效的疫苗，这不单归因于细胞免疫比体液免疫更为重要，而且发现1.天然病原体的感染会通过其“不合理”的表位组分引起Th1/Th2平衡改变而继发免疫偏差、免疫缺陷或通过引发免疫活性细胞间的“互相残杀”的机制加重感染过程和病理过程。2.由于进化的原因，天然病原体或抗原上含有各种不同的细胞因子、补体或化学趋化因子受体等高同源性顺序，从而干扰细胞间通讯，产生免疫颠覆。病原体通过这些机制逃避机体的免疫清除，而导致病原体携带状态或持续感染状态。因此新一代疫苗必须能够诱发出在性质和强度上与自然感染过程又所不同的免疫反应，所以就有了目前各种天然抗原的组合疫苗。

　　但是，天然抗原的组合并没有获得很大的进展。随着模拟表位的发现，吴教授提出了模拟抗原的概念。在乙肝疫苗的设计中提出了模拟抗原代替天然抗原的思路。

　　作为治疗用（合成肽）乙肝疫苗，它的理论基础就是免疫识别新理论的表位生物学，氨基酸密码学说。此外，通过吴玉章自创的基于表位的疫苗设计路线（EBVD）

　　来实现以上理论指导下的乙肝疫苗设计。

　　该类疫苗根据现代免疫抗原提呈理论、治疗机理的独创性和可行性，主要是通过结构化学、计算机模拟配对技术。经过分子设计，重新构建，以获得与原天然病毒蛋白结构类似，但又不同的新免疫刺激分子。在全世界，这一技术路线也只有第三军医大的吴玉章采用。该技术路线是以乙肝抗原表位图谱为基础，采用肽扫描技术、窗口分析技术和氨基酸残基置换方法确定了HBV保护性抗原的B、Th、CTL细胞表位和表位内的必需氨基酸残基；在此基础上，按照不同类型表位、不同抗原来源表位、不同的连接顺序、不同的化学修饰基团等，采用EBVD方案进行设计、筛选。表位组分的来源范围包括：HBV的s抗原、e抗原、e抗原的线性优势B细胞表位、T辅助细胞（Th）表位、细胞毒性T细胞（CTL）表位，来源于其他抗原的线性通用Th细胞表位、表位修饰基团。在表位修饰基团中考虑了可促进免疫活性的单链脂肪酸和糖类基团。

　　表位间的连接顺序采用已证明对抗原性（免疫原性）无影响的-A-A-A-或-G-G-G-或-K-S-S-。采用分子模拟方法，比较了所设计抗原多肽的结构与天然抗原之间的相似性、与MHC结合的位阻情况等，并对抗原多肽进行免疫原性、理化、生化特性分析，排序。3．治疗用（合成肽）乙肝疫苗相关机理基础治疗用（合成肽）乙肝疫苗，通过基于表位疫苗设计路线（EBVD）方法，设计特异性主动免疫治疗药物。来解决由于Th1/ Th2细胞极化的失衡导致Th1细胞、和CTL细胞的功能低下，不能够清除有感染病毒的肝细胞，从而机体表现为持续感染状态的免疫耐受问题。Th1主要参与细胞毒性T（CTL）细胞介导的细胞免疫，解决胞内感染问题中发挥重要作用。而Th2主要功能在于刺激B细胞增殖及嗜酸性粒细胞活化，促进抗体(IgG1与IgE)产生，参与体液免疫，在抗细胞外感染与致敏原引起的免疫应答中起关键作用。越来越多的证据表明Th1/ Th2细胞极化是免疫应答调节中的关键环节。Th1/ Th2细胞极化异常或缺陷均可以导致疾病，如慢性感染、自身免疫性疾病或变态反应。所以Th1/ Th2细胞极化是目前免疫应答研究的热点。现已证实，Thl、Th2细胞是Th前体细胞(pTh)在特定抗原刺激及多种信号综合作用下．发生功能性极化的结果。pTh指未受抗原刺激、处于原始状态的细胞(也称为naive cel1)，在抗原刺激后分化为中间状态的Th0细胞，在多种因素的综合作用下．Th0选择性地往Thl或Th2方向分化。究竟是何信号诱导Thl／Th2极化?这种极化的分子机制是什么?已成为免疫功能紊乱与免疫调节、移植免疫、感染及肿瘤免疫等研究领域中急待弄清的环节。已有的研究表明，细胞因子、抗原、抗原递呈细胞(APC)、共刺激信号及一些基因调控因子均为Thl／Th2极化提供了重要信号。

　　Th细胞的功能性极化对于调节机体免疫功能是至关重要的。许多免疫性疾病与Th极化异常有关，如AIDS患者体内存在着Thl向Th2应答的显著偏移，增强Thl应答能缓解病情；肿瘤细胞多分泌Th2型细胞因子使机体处于Th2优势应答状态，这可能是肿瘤免疫逃逸机制之一。Th极化是一个多信号参与的复杂过程，弄清Th1／Th2极化的分子机制，对于在免疫功能紊乱状态下诱导Th细胞极化平衡，针对不同的免疫性疾病诱导某种Th细胞的优势极化，以及发展特异性免疫治疗等，具有指导意义。

　　我们认为理解Th1／Th2极化的分子机制与CTL的相关性是目前的治疗性疫苗的核心。

　　杀伤性T细胞又称为细胞毒性T细胞(CTL、主要参与抗病毒、肿瘤免疫及移植排斥反应。静止的CTL前体细胞通过其TCRαβ识别靶细胞或抗原提呈细胞表面的抗原肽一MHC l复台物”、被活化为抗原特异性的细胞毒效应细胞，并通过颗粒外吐和受体介导的机制(如Fas／FasL途径、TNF／TNFR途径等)杀伤靶细胞。多年的研究表明，辅助性CD4+T细胞存在着功能性极化反应，而该极化反应的平衡对诱导或抑制CTL的活化及功能有着重要的调节作用。

　　机体维持正常的免疫功能状态．有赖于细胞免疫与体液免疫间的平衡，该平衡在很大程度上受CD4+Th细胞功能性极化及CTL应答所控制。

　　Th1细胞与CTL活化许多实验发现有效的CTL活的产生需要多步诱导及多种信号，并证实了给予Th细胞辅助比单个刺激分子更加有效：

　　CD4+Th细胞接受APC提呈的抗原信号后。其膜表面可大量表达CD154分子，CD154与APC细胞表面的CD40分子结合，可引起APc活化并分泌大量IL-I2，IL-12又可反过来作用于Th及CTL。表明Th1与CTL活化密切相关。

　　在某些病毒感染细胞及肿瘤细胞可表达Fas，而CTL及Th1细胞被抗原激活后可迅速高表达FasL，但Th2却很少表达FasL，故CTL及Th1细胞可通过不依赖穿孔素的FasL途径，使靶细胞死亡。CTL在抗病毒感染的免疫反应中占有重要地位。而CD4+辅助性T细胞亚群Th1、Th2的平衡在抵御病毒感染中起了同样重要的作用。

　　HBV感染在大量乙型肝炎病毒感染的病例研究中．发现急性自限性肝炎与高效的CTL应答之间有着密切联系。但在慢性乙肝患者体内，CTL活性通常是较弱的，甚至缺乏。在慢性HBV感染中，肝浸润性CD4+T细胞主要是Th0或Th2细胞；相反，在急性自限性肝炎中，肝浸润性CD4+T细胞主要为Th1型细胞。表明以Th1为主的应答促进细胞介导的免疫，与更好地控制病毒感染及延缓慢性疾病的发作有关。

　　慢性肝炎患者体内高水平的循环病毒抗原可能是产生CTL对抗原特异性耐受和Th1朝Th2转换的原因之一。

　　治疗用（合成肽）乙肝疫苗（从本质上应该称为药物）的核心就是要上调Th1细胞的活化数量和CTL细胞的功能。以期达到彻底清除肝细胞的目的。有关体液免疫方面，我们已经取得了非常大的成功（在预防性疫苗上），但是作为治疗用（合成肽）乙肝疫苗，在提高体液免疫反应的同时，更加注重细胞免疫，加强CTL效应。该疫苗在表位设计上，利用了HBcAg来源的CTL表位（21～30位氨基酸残基）、破伤风类毒素来源的通用Th细胞表位（4～17位氨基酸残基）、PreS2来源的B细胞表位（34～44位氨基酸残基）和棕榈酸分子(N末端)各一个拷贝。同时考虑了MHC限制位间的相对位置及其间隔顺序等。体液免疫只能够杀死血液里面游离的病毒颗粒，对于细胞内感染需要通过细胞免疫来解决。该疫苗主要通过细胞免疫中CTL细胞的CTL效应来清除胞内感染的细胞。

　　通过HBcAg来源的CTL表位（21～30位氨基酸残基），激活细胞免疫中CTL细胞的CTL效应。同时PreS2来源的B细胞表位和破伤风类毒素来源的通用Th细胞表位，能够有效的增强CTL效应。这里主要介绍CTL效应是如何识别和杀死带病毒的肝细胞的。

　　1．CTL的免疫识别免疫识别是机体免疫系统产生特异性免疫的基础，通过对抗原的特异性免疫识别．激发机体产生免疫应答最终由效应细胞和，或效应分子(Ab)清除病原体或异己物质近年来，细胞毒性T细胞(CTL)引起人们的重视，发现人类面临的多种难以攻克的疾病．如肿瘤、AIDS、乙型肝炎等，CTL在疾病治愈中扮演着关键角色。

　　CTL仅能识别表达于抗原提呈细胞(APCs)表面并与MHCⅠ类分子结合成复合物的肽类抗原。其它共刺激分子如CD3、CD8和辅助分子IFA-1、CD28等可分别与相应配体结合，提供CTL激活的共刺激信号．有助于T细胞对外来抗原的精确识别。

　　虽然抗原在APC中加工的分子事件并不完全清楚，但已有动物实验的证据表明：

　　可能传统的MHCⅠ分子、MHC1ike分子、CD1等参与了交叉呈递和交叉激活；分子伴娘(如热休克蛋白)对于交叉呈递和交叉激活至关重要；而抗原的特性起最关键的作用。既往由于“可溶性蛋白不能在体诱导CTL活性”，因此实现可溶性蛋白在体内诱导CTL活性一直难以突破。但在这些认识的启发下通过抗原的设计对实现可溶性蛋白在体内诱导CTL活性取得重要突破。吴玉章提出了抗原工程(antigen engineering)的概念及模拟抗原(mimogen)、模拟病毒(mimovirus)的概念，采用APC靶向技术、MHCⅠ呈递途径靶向技术(proteasome靶向、endosome靶向、内质网靶向等)可启动CTL应答，探索到颗粒抗原、分子内佐剂抗原可有效在体内诱导Th1极化和CTL应答。在此基础上，建立了基于表位的治疗性疫苗设计路线(epitope．based vaccine design，EBVD)，并筛选到了乙肝和肿瘤治疗性疫苗的先导结构。

　　CTL抗原直接识别和活化机制吴玉章在实验研究中发现一些经特殊修饰(如：磷酸化、人工糖基化)的多肽抗原可直接活化CTL。T细胞作为非职业APC的意义目前并不清楚，但直接被抗原活化则具有重要的理论意义和应用价值。此种识别是由传统MHCⅠ类分子介导或是其它分子介导正在进一步研究中。非职业APC表面的空(未结合表位)MHCⅠ类分子、MHC-like分子的代谢动力学及其意义是弄清这一问题的前提。

　　CTL的效应机制CTIL的效应机制一般认为，CTL细胞毒作用主要依赖于穿孔素－颗粒酶途径和FasL-Fas介导的细胞凋亡途径。前者发生较早，约占细胞毒60％一70％权重，后者发生较晚，约占30％一40％权重。

　　不同细胞毒T淋巴细胞亚群的杀伤靶细胞机制略有不同CD8+ CTLs主要通过颗粒依赖性途径杀伤靶细胞和病原，DN CTL(CD8- CD4-)主要是通过FasL-Fas介导且不能杀伤病原体；而CD4+CTLs可通过任一途径杀伤靶细胞。

　　在细胞内感染CTL清除病原体的作用是否以牺牲宿主细胞功能为代价?最近国外两家实验室在乙型肝炎模型证实：乙肝抗原特异性CTL在清除病原的同时并不造成肝功能损害。吴玉章的实验结果也证实了这一现象。有人推测疾病状态下CTL造成肝功损害是由于病毒非特异性CTL所致。这提示CTL的效应机制及其在肿瘤和细胞内感染中的不同之处目前还不完全清楚。

　　相关机理基础小结：从上面有关乙肝免疫耐受的机理、治疗用（合成肽）乙肝疫苗有关的免疫识别理论（表位生物学、氨基酸密码学说），影响Th1/Th2细胞极化的多重因素，CTL效应与Th1/Th2细胞极化的关系，CTL免疫识别和效应，以及吴教授的基于表位的疫苗设计路线（EBVD）的阐述来看。我们认为该疫苗的设计路线新颖，理论成熟可靠，具有很高的实用价值。打破乙肝病毒免疫耐受的概率极大。

　　4．治疗用（合成肽）乙肝疫苗相关实验情况吴玉章采用Chou和Fasman方法预测adw，adr，ayw三种亚型的己肝病毒Pre-s2蛋白的二级结构，并用双亲性方案和亲水性方案分析了抗原表位。结果显示三者均可能含有较多的β-片层和β-转折，N末端30个残基所形成的二级结构较保守，而c末端顺序的构象在亚型间差别较大，Th细胞识别的表位可能在39-49肽段，B细胞识别的袁位可能主要在l3一l8残基或其附近，为分子免疫学的深入研究提供了线索。

　　吴玉章采用自己实验室建立的短肽点免疫结合试验确定了Pre-S2蛋白B细胞表位的精细特异性．这对设计新一代疫苗及诊断试剂有指导意义。

　　在对PreS蛋白进行了高分辨率免疫识别研究基础上，以PreS蛋白的优势B细胞表位B1、B2为基础，引入不同的Th细胞表位Thl、Th2以观察不同表位组合与搭配对免疫原性的影响；设计、合成四分枝MAP肽并与线性多肽PreS2蛋白相比较，观察分枝肽设计对免疫原性的影响。结果显示此种MAP多肽均比PreS2诱发更高抗体滴度；Th细胞表位引入可显著增强反应强度。增加肽抗原结构复杂性可提高其免疫原性，其表位排列以B细胞表位在赖氨酸核心外侧为佳，MAP是一种较好的肽苗结构。

　　吴玉章在实验中发现，MAP肽诱发的免疫反应明显高于对照的线性Pre-S2蛋白和Pc，证明MAP肽的结构能明显提高抗原肽的免疫原性，提示分枝肽结构可能部分恢复其大分子特征。在MAP肽抗原表位经重新搭配、组合，表位分子内环境已不同于原来的天然蛋白，在恢复其大分子特性后，提高了其免疫原性。虽然表位氨基酸序列末变，但其构象是如何变化，抗原进入体内到淋巴细胞和活化需经过抗原被吞噬、降解、呈递多个复杂的环节。在体内激发的抗体是否还能识别原来的天然蛋白抗原?该研究以Pre-S蛋白为包被抗原，检测不同免疫原激发的抗体与Pre-S的交叉反应，研究发现MAP1和MAP2产生抗体都能和Pres蛋白结合，说明含有Pre-S蛋白B细胞表位的MAP肽所激发的抗体仍能识别Pre-S蛋白，因此，该抗原的免疫特异性是由特异性氮基酸序列决定MAP结构的引人是替代传统肽交联蛋白载体并提高免疫原性的有效办法。

　　构建有效的新型抗原肽，必须研究T、B细胞表位的不同组合，研究引入了两个能够协助HBsAg特异性B细胞产生抗体的Th细胞表位，连结于MAP肽的核心端。研究发现MAP1、MAP2及Pre-S蛋白都能刺激特异性淋巴细胞发生增殖，且相互之间没有交叉刺激作用。说明活化的淋巴细胞亚群为抗原特异性的。既往研究表明：仅采用单一B细胞表位的构建MAP肽，其免疫原性仍不够理想。PreS蛋白能刺激免、小鼠T细胞的活化，Pre-S蛋白产生抗体滴度明显高于对照的Pc。而Pc有能被小鼠MHC分子识别的T细胞表位，可能与在小鼠诱发的抗体滴度稍高于对照免疫有关。以上实验说明，引入Th细胞表位能增强抗原肽的免疫原性。值得一提的是，MAP1对小鼠淋巴细胞ST的增殖作用明显高于其它抗原(P<0．05)。但MAP1诱发的抗体滴度并非最高，而低于MAP2，是否抗体产生主要决定因素在于B细胞表位的免疫原性? Th细胞的活化在抗体产生的定量如何，尚需进一步研究。

　　在构建完Pre-S蛋白B细胞的基础上，利用已研究的HBcAg中CTL表位，破伤风类毒素通用的Th细胞表位，以及分子内脂类佐剂为设计基础。设计了新一代的疫苗。

　　相关的试验情况如下：

　　治疗用HBV模拟抗原的设计及其诱导慢性乙型肝炎患者外周血CTL活性研究论文中。

　　首先，是通过引入四聚体技术，比较基于不同表位组合的模拟抗原分子的免疫原性，研究其结构与诱导免疫应答之间的关系。以乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)18—27表位为基础，分别引入了Th、Th+B细胞表位，合成了3种模拟抗原，并以这3种模拟抗原在体外刺激慢性乙型肝炎患者的外周血单个核细胞为模型，通过HLA-A2*0201 tetramer定量检测抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)。在研究中以血清HBsAg、anti-HBc、anti-HBe阳性、血清谷氨酸丙酮酸转氨酶(肝脏炎症的衡量指标)、HBV DNA水平低、HLA-A2+的慢性乙型肝炎患者为研究对象是基于此类患者外周血中存在的CD8+T细胞特异性地识别病毒后能够有效的增殖以控制病毒复制。因此选取此类患者用于所设计的模拟抗原能有效地诱导产生特异性CTL反应的研究。

　　结果显示3种模拟抗原分子能有效地诱导慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞产生抗原特异性CTL反应；Th和B细胞表位的引入可增强该效应。所建立的四聚体技术可定量检测表位特异性CTL；模拟抗原的设计中引入Th、B细胞表位可增强其免疫原性。

　　血清中和抗体的检测多肽Pl和P2不能诱导小鼠产生中和抗体，多肽P3 JJlJ强免疫4次后，可产生适度的中和抗体，其滴度约为1：670对照肽组未检测到抗体产生。

　　模拟抗原诱导T细胞Th1／Th2型极化的分析用双抗体夹心EL1SA法检测小鼠免疫血清中细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ等细胞因子谱的分泌量变化，间接分析T细胞极化情况。结果表明，P3诱导Thl、Th2型细胞极化的能力均较强，并以Thl型极化为主；多肽Pl、P2及Mart-1 27-35均能诱导较弱的Thl型T细胞极化。各模拟肽抗原结果差异显著(P<0.05)．6．疫苗项目总结目前，无论是蛋白疫苗、DNA疫苗还是多肽类疫苗，国内外现有研究开发，主要集中在天然抗原选择搭配、在预防性疫苗的制剂中添加抗原或抗体的方式。而且除多肽类疫苗是在表位识别水平外，其余的都是在蛋白大分子水平上。目前所有的治疗性乙肝疫苗没有出现有效治愈的案例，没有取得突破性的进展。在天然抗原的组合和搭配上进行了多年的探索，依然是没有取得突破性的近展。主要是由于天然抗原产生的免疫耐受、免疫偏差、免疫颠覆基本上是同时存在，因此仅仅依靠天然抗原的组合难以解决乙肝病人的免疫耐受。随着模拟表位的发现，吴玉章在乙肝疫苗的设计中提出了模拟抗原代替天然抗原的思路，首创了表位识别的氨基酸密码学说和模拟抗原的分子设计理念，来克服天然抗原的免疫弱势和蛋白大分子的免疫偏差和免疫颠覆。

　　从有关乙肝免疫耐受的机理、治疗用（合成肽）乙肝疫苗有关的免疫识别理论（表位生物学、氨基酸密码学说），影响Th1/Th2细胞极化的多重因素，CTL效应与Th1/Th2细胞极化的关系，CTL免疫识别和效应，以及吴教授的基于表位的疫苗设计路线（EBVD）的阐述来看。我们认为该疫苗的设计路线新颖，理论成熟可靠，具有很高的实用价值。打破乙肝病毒免疫耐受的概率极大。

　　从临床前的实验资料可以看出，吴玉章有关乙肝疫苗的相关研究进程，是一个层层递进的关系，目前公开资料中，显示该疫苗到动物试验结束之前，都是非常不错的效果，从中，我们也能够看到该疫苗的理论基础和设计方法在实践中获得了验证。根据吴教授公开的实验数据和相关免疫指标的检测，以及在动物试验中的良好结果，我们认为非常有可能在人体内出现一个特异性的免疫应答，从而达到打破免疫耐受和彻底治愈乙肝的目标。

　　治疗用（合成肽）乙肝疫苗相关技术的核心是基于表位生物学和氨基酸密码学说，通过特异性免疫，纠正免疫偏差、免疫颠覆、激发免疫效应，达到特异性免疫治疗的目的。所以该项目的相关技术能够应用的领域包括慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、认知性疾病等。