附子酸性多糖提高免疫低下小鼠免疫功能的实验研究|毕业论文网

附子酸性多糖提高免疫低下小鼠免疫功能的实验研究
作者：苗智慧 刘京生 王燕凌 董兰凤 韩彩芝 韩艳青 郑晓莉
【摘要】  目的 观察附子酸性多糖对环磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫功能的影响。方法 采用植物化学方法得到附子酸性多糖，以灌胃和腹腔注射2种方式给药，观察免疫低下小鼠的胸腺、脾脏指数，腹腔巨噬细胞吞噬功能，血清溶血素，淋巴细胞转化 率，自然杀伤细胞活性以及外周血白细胞计数等多项指标，与对照组比较评价附子酸性多糖对免疫低下小鼠细胞和体液免疫功能的影响。结果 附子酸性多糖可显著提高正常小鼠和免疫低下小鼠的脾脏和胸腺指数，提高小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能和抗体产生能力，促进淋巴细胞增殖，增强自然杀伤细胞活 性，并且可以显著提高白细胞数量（P<0.05或P<0.01）。腹腔注射较灌胃给药的效果更为明显(P<0.01）。结论 附子酸性多糖可以显著提高免疫低下小鼠体液免疫和细胞免疫功能，并可减轻由于环磷酰胺引起的白细胞降低，具有减轻化疗药的毒副作用。且不同给药途径可影响 其疗效。附子酸性多糖具有广阔的开发应用前景。
【关键词】  动物,实验;附子；免疫系统；药物作用; 溶血素类；小鼠
【Abstract】  Objective  To observe the effect of Monkshood acid polysaccharide on immunologic function in immunosuppressive mice. Methods  The acid Monkshood polysaccharide (AMP) was obtained by phytochemistry extraction. The immunosuppressive mice models were made by injecting cyclophosphamide intraperitoneally. The immunosuppressive mice were administrated by gavage and intraperitoneal injection with AMP. The thymus and spleen index, phagocytosis of macrophages, hemolysin, lymphocyte transforming rate,NK cell activity and peripheral-blood WBC were detected and compared with those of model mice to evaluate the effect of acid Monkshood polysaccharide on the humoral and cell immunological function in immunosuppressive mice. Results  AMP could enhance the index of spleen and thymus of immunosuppressive mice,and increase the phagocytic activities of peritoneal-blood macrophage, the ability of antibody forming and lymphocyte transforming rate, and increase the activities of NK and the counts of WBC. There were significant differences between experimental groups and control group (P<0.05 or P<0.01). The effects of intraperitoneal injection was superior to those of gavage administration(P<0.01). Conclusion  AMP could increase humoral and cell immunity function of immunosuppressive mice,moreover, which could relieve the decrease of WBC caused by cyclophosphamide。The results showed that the effects of AMP would be influenced by different administration ways. AMP has broad development and application prospect in clinic.
【Key words】  Animal;Experiment;Monkshood;Immune system;Drug effect; Hemolysin; Mice
近年来研究表明,附子提取液具有强心、抗癌、抗衰老和增强免疫机能的作用［1］,但关于附子多糖对免疫功能低下的机体的影响至今国内外尚无报道。我们采用 腹腔注射与灌胃给药2种不同的给药方法以及不同的给药剂量系统地研究了附子酸性多糖对免疫低下小鼠的体液免疫和细胞免疫功能的影响，以阐明附子酸性多糖对 机体免疫功能的作用及可能的影响机制,为临床应用提供实验依据。
1  材料与方法
1.1  实验材料
1.1.1  原料
黑附子购自石家庄乐仁堂中药店，由河北医科大学药学院生药教研室聂风礻是教授鉴定。
1.1.2  试剂
无水乙醇、95%乙醇、三氯甲烷（氯仿）均为天津市天大化工实验厂生产，正丁醇为上海试剂一厂生产，硫酸铵为北京化工厂生产。ConA和MTT为Sigma公司产品。注射用环磷酰胺(Cy),上海华联制药有限公司生产,批号:061110。
1.1.3  实验动物
清洁级BALB/c小鼠,雌雄各半,体质量(18～20)g,由中国医学科学院实验动物繁殖厂提供，动物合格证号：医动字第01-3004号。
1.1.4  实验仪器
CO2培养箱（美国Forma Scentific）;550酶标仪（Bio-Rad）公司; 722分光光度计（上海第二分析仪器厂），流式细胞仪（美国FACS-420），Coulter血液计数仪（美国贝克曼公司）。
1.2  方法
1.2.1  附子酸性多糖的提取
按文献［2］方法提取附子酸性多糖，以α-萘酚反应（Molish反应）进行鉴定。
1.2.2  实验分组
小鼠随机分为6组,每组10只。正常对照组腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.4 mL/(只·日)；模型对照组腹腔注射等容积环磷酰胺100 mg/(kg·日),连续给药5日，第6日开始注射0.9%氯化钠注射液0.4mL/(只·日)；实验组在模型对照组的基础上分高、低2个剂量并分别以灌 胃和腹腔注射2种方式给药，高剂量组药物浓度为20 mg/mL,低剂量组药物浓度为10 mg/mL,灌胃给药（po）0.4 mL/（只·日）,腹腔注射给药(ip)0.4 mL/（只·日），每日1次,连续15日。
1.2.3  小鼠免疫器官质量测定
于末次给药次日，处死小鼠后，称取胸腺、脾脏质量，并计算胸腺、脾脏指数。
1.2.4  腹腔巨噬细胞吞噬功能测定
参照文献［2］方法进行，计算吞噬指数和吞噬活性。
1.2.5  血清溶血素测定
用改良方法［3］检测小鼠血清抗体溶血素生成，按下列公式计算样品血清溶血素(HC50)：样品HC50 =样品的光吸收值/SRBC溶血时光吸收值×稀释倍数。
1.2.6  淋巴细胞转化率的测定
用改良的MTT法［3］，最后求出淋巴细胞转化指数：转化指数=加ConA孔的OD值/不加ConA孔的OD值。
1.2.7  自然杀伤（ NK）细胞活性检测
用乳酸脱氢酶释放法（LDH）检测NK细胞活性［4］，靶细胞为小鼠脾细胞，效应细胞为Yac-1细胞，效靶比为100∶1。
1.2.8  外周血白细胞计数
于处死小鼠前从后静脉丛采血20 μL,用Coulter血液计数仪检测各组小鼠的白细胞数量。
1.2.9  统计学处理
所有数值以均数±标准差(±s)表示，各组间计量数值采用两组间t检验。
2  结  果
2.1  附子酸性多糖对小鼠胸腺和脾脏指数的影响
见表1。表1  附子酸性多糖对小鼠胸腺和脾脏指数的影响（略）
由表1可见，附子酸性多糖可以提高免疫低下小鼠的胸腺和脾脏指数，与模型对照组比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），尤其是 腹腔注射组的效果较灌胃组更为明显(P<0.05，P<0.01)，而高剂量组与低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2  附子酸性多糖对小鼠巨噬细胞吞噬指数和吞噬活性的影响
见表2。表2  附子酸性多糖对小鼠巨噬细胞吞噬指数和吞噬活性的影响（略）
由表2可见，附子酸性多糖可以提高免疫低下小鼠的巨噬细胞吞噬指数和吞噬活性，与模型对照组比较差异有统计学意义 （P<0.05，P<0.01），而高剂量组与低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)，相同给药剂量ip组与op组比较无统计学意 义（P>0.05）。
2.3  附子酸性多糖对小鼠NK细胞活性和淋巴细胞转化指数的影响  见表3。表3  附子酸性多糖对小鼠NK细胞活性和淋巴细胞转化指数的影响（略）
由表3可见，细胞免疫功能检测表明附子酸性多糖可以促进免疫低下小鼠的淋巴细胞增殖，增强NK细胞活性，与模型对照组比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），而高剂量组与低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。
2.4  附子酸性多糖对小鼠血清溶血素和白细胞数量的影响
见表4。表4  附子酸性多糖对小鼠血清溶血素和白细胞计数的影响（略）
由表4可见，腹腔注射环磷酰胺可以导致小鼠白细胞显著减少，而附子酸性多糖2种给药途径均可提高白细胞数量，各给药组与模型对照组比较差异均有统计学意义 (P<0.01)。附子酸性多糖可以提高免疫低下小鼠的抗体产生能力(血清溶血素)，酸性多糖组与模型对照组比较差异有统计学意义 （P<0.01）,表明其除了提高细胞免疫功能的作用外，还可以提高机体的体液免疫水平。
3  讨  论
附子是毛蔑科乌头属(Aeonitum earn1ichad Debx.)植物的侧根,是一种常用的中药材,具有回阳救逆、温补肾阳、祛寒止痛之功效。近年来有文献提到附子提取液具有强心、抗癌、抗衰老和增强免疫机 能之功效。我们先前的实验证实附子多糖具有抗肿瘤作用［1］，而其机制与增强机体的细胞免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡和调节癌基因的表达有关。
实验结果表明,附子酸性多糖可以提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠的体液免疫和细胞免疫各项指标，与模型对照组相比差异有统计学意义 (P＜0.01，P＜0.05)。尤其是通过腹腔注射途径可以得到更好的增强免疫功能的效果，这与我们所做的附子多糖抗肿瘤实验研究的结果一致［1］，其 机制可能是腹腔注射可以更直接进入机体，而口服给药可能在胃肠道消化吸收过程中对药物会产生一定的影响。实验表明附子酸性多糖低剂量组与高剂量组提高机体 细胞免疫功能的作用无明显差异，中药的量效关系是一个非常复杂的问题，有关文献的研究结果不尽相同［5］，这一课题值得进一步研究。而附子酸性多糖还可以 提高环磷酰胺造成的白细胞减少，这一作用对于应用化疗治疗肿瘤的患者具有重要的意义，我们的实验结果与有关文献报道一致［6］。环磷酰胺为临床常用的抗肿 瘤药物，但在治疗过程中，经常给患者带来很多副作用，尤其是对机体免疫抑制的副作用，影响了其治疗的功效。而附子酸性多糖可以提高环磷酰胺造成的免疫低下 小鼠的体液免疫和细胞免疫功能，并提高白细胞数量，这为今后临床用于减轻化疗药的毒副作用，提高患者的免疫功能，特别是增强机体细胞免疫功能，对肿瘤的治 疗将起到相得益彰的作用。本研究结果为临床应用提供了可靠的实验依据，因此，附子酸性多糖是一种具有广泛开发前景的中药制剂。
【参考文献】
［1］董兰凤，刘京生，苗智慧，等.附子多糖对H22和S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究［J］.中国中医基础医学杂志，2003，9(9):14-17
［2］李仪奎，王钦茂.中药药理实验方法学［M］.上海：上海科学技术出版社，1991：157-158
［3］徐叔云.药理实验方法学［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2001：1426-1427
［4］朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法［M］.北京：人民军医出版社，2000：199-202
［5］陶有青，边玉麟.中药量效关系理论及临床应用初探［J］.安徽中医学院学报，2006，25(3):1-2
［6］商捷，刘军，李可欣，等.香菇多糖对放化疗致动物白细胞减少症的影响［J］.沈阳药科大学学报，2006，23(12):791-796