ccyting's blog - 标准曲线的探讨 | 丁香博客-专业就是做自己的品牌

标准曲线的探讨
任何一个色谱方法都需要有标准曲线来建立定量的标准。我们经常讨论有关这方面的问题。但是我们似乎也对这个课题可能没有全面的了解。我不是危言耸听，而事实的确存在。我觉得实在有必要把标准曲线的来龙去脉说个清楚。也希望同行们能够不吝指教。毕竟每个人看法，想法，做法多少都会有出入的。就算我来个抛砖引玉吧。
当然首先我们必须有一个固定的色谱方法，这个方法是以等度色谱为主。重点只是检验主成分。条件是进样量要小，然后走样的时间不超过10分钟（越短越好）。因为进样量小，所以可能出现的杂质或有关物质，我们都无法看到。然后开始看看我们的标准曲线。一般标准曲线的范围是根据我们要分析的靶点浓度(target concentration)来决定。也就是在我们对某一样品进行分析的时候，所采用对照品的浓度。因为我们没有必要在每次分析的时候，都连续进样不同浓度的对照品，建立标准曲线，然后从标准曲线来求得样品的浓度。但是当我们用单一靶点浓度来定量的时候，我们是需要使用标准曲线来检验单一靶点浓度来定量的可行性。那我们如何来决定对照品的单一靶点浓度呢。首先我们使用对照品来决定Quantitation Limit(定量限)及Detection Limit (可测限)。在这里我要强调的就是假设我们要定量主成份（不是杂质或相关物质），因此我们强调的是准确度(precision) 及精确度(accuracy)。所以标准曲线的下限，大概设在高於2到3倍的QL。QL的要求就是在连续进样六次的%RSD要小於1%。有了这下限浓度，我们就可以决定上限的浓度。这时可以看我们分析制剂样品的含量。把制剂的含量，经过稀释后的浓度（1:100 或1:1000) 定为我们的靶点浓度。而这一点最好在标准曲线的中点。美国FDA规定的标准曲线范围只是靶点浓度的上下限百分之五十。如果靶点浓度是10 mg/mL，那上下限就是5 到15 mg/mL。所以看看通常我们做的标准曲线是往往超过这个范围的。
有了对照品的上下限浓度，我们就可以配制两个接近浓度的对照品。一个做为工作对照品(working standard)，另外一个做为检验对照品(check standard, monitoring standard, standard check)。把工作对照品做一系列的稀释，最好有6个不同浓度。每样我们进六针，一共就是36组数据。有了浓度，有了相对的峰面积，我们就可以做线性分析(linear regression analysis)了。有的人把(0,0)算入标准曲线的一点那是不对的。因为即使您打空白样品，没有峯，面积绝不是0。因为，我们使用紫外检测器，是有基线信号的。而我们的检测器无法测出基线的面积啊。测不出来并不表示没有（当然，有人说我们用的检测器可以设置参考波长啊，以后我们可以再讨论）。您看，当我们用一般光谱仪器的时候，我们是可以把空白放在另外一个槽中测吸收值(absorbance)。但是色谱的检测器没有多一个槽，也就无法测量流动相的吸收了呀。您看，RI 检测器就可以把流动相打入槽中做为背景信号啊。
建立了标准曲线，就有两种可能性。一种情形就是曲线经过原点或者非常接近原点。经过原点的这种情况很少。如果您使用長波长，或者使用的有机流动相吸收小。因为基线的吸收小，所以曲线是可以经过原点的。因为，我们看到任何样品的信号其实都包含了基线的信号。如果是这种情形，您可以使用标准曲线上的任何一点来做单一曲线的靶点来定量。而样品的浓度，可以配制到锁定标准曲线浓度内。这时后我们说我们分析的偏差(analytical bias)接近於0。另外一种情形，是我们经常看到的就是标准曲线不经过原点。不经过原点就是说有一定的分析偏差。 如果我们要避免偏差，我们就必须要使用标准曲线来定量。也许我们不需要每次用6个浓度，可以缩小为三个点，但是必须横跨下限，中限及上限（必须与6个点的曲线比较而且认证）。这样还是麻烦啊，所以我们想办法只要用一个靶点浓度来定量，而且（与标准曲线比较）偏差不会太大。要达到这一个目标，当然是选择高浓度的对照品。因为，选择高浓度的对照品，基线的信号相对的影响就小。可是，在定量上，我们是希望进量样越小越好，这样不影响我们的准确度，也不至于看到我们不想看到的杂质或相关物质。通常我们就选择中间点，做为我们的靶点浓度了。
我们把标准曲线做好了，把曲线的方程式求出来，就可以得到一些统计的数据。这个时候 我们可以把每个浓度的峰面积带入方程式，求出浓度的实验值。这是实验值与原来配制的浓度比就是我们的回收率。这个回收率是根据标准曲线求出的。回收率当然是应该接近100%的。也就是我们的分析偏差接近於0。另外一方面，我们可以分别使用每一个对照品的浓度，求出该浓度的响应值(response factor)，有了这个响应值，我们可以根据其他浓度的峰面积，求出每个浓度的实验值。有了这个实验值，我们可以与原来的配制浓度求出回收率。您就会发现，以高浓度为对照品来定量低的浓度回收率越小。反之亦然。如果以一个浓度来定量同样浓度，分析的偏差就不存在了。这也就是我们可以选择单一靶点浓度来定量的根据。但是要记住的就是样品的浓度一定要配制到对照品单一靶点的浓度。否则，偏差自然就大了。一般我们做色谱，除了杂质或相关物质。为了能够检测到0.1%的含量，我们通常是需要注射大量的样品。注入大量的样品，自然有许多问题。尤其在定量主成份上。所以，我是主张用两个单独的方法。一个是用来定量主成份，进样量小，时间短的等度色谱法。另外一个就是梯度，长时间，进样量大的方法来定杂质及有关物质。有问题，我一定尽量回答。同时也由衷知道您的想法。
对 "标准曲线的探讨" 的评论: (共 5 条)
kidpk  发表于 2009-08-10 22:30引用
非常实用，虽然我不是学分析的，但感觉博主以后可以写一本书，算是这方面的经验之谈，嘿嘿~
owenjohnson  发表于 2009-08-12 00:45引用
前辈您好，我是学中药的，看到您的文章感触很深，对于医药行业前辈有几十年的经验与独到的看法，很多问题想请教，特地在这个网站注册了个用户名，但是还是没有发现小纸条的功能在哪里。。。不是是否可以给晚辈一个邮箱地址，以便更好的请教，谢谢
匿名  发表于 2009-08-13 12:29引用
博主:带领大家探讨美国一些情况吧,请问单方中药材通过分离其活性成分,在美国可直接申请专利?申请下来要2-3年?辉瑞的专利全是分子式,来源出处可以不讲?有朋友有偿帮写美国专利吗?hodli@yahoo.com,
花大熊  发表于 2009-08-15 20:50引用
前辈的方法已经是基础的不能在基础了。主要是从建立方法的角度来预期误差的来源以及所采取的对策。
前辈在其他回帖中所说的加样回收的方法似乎未包含在内。加样后的浓度应该也要控制在中点附近的啊。
另外选取六个点做标准曲线的理论依据是什么啊？国内一般好像选的是5个。一直就这么做，也没有深究过。
如果手动进样的话，精确度往往和实验者的水平有关，有没有办法消除这个误差的来源。毕竟国内很多设备没有配自动进样装置。
标准曲线的相关系数有什么要求啊？
ccyting  发表于 2009-08-15 23:48引用
加样回收一般是做80%，100% 及120%三个浓度。我觉得5 个或6个没有那么关键。我们在这里都是做6个。我想做六个，至少可信度比较高吧。其实早年没有自动进样器的时候，我们都是用手进样的。后来有了进样器，我们的工厂还是用手进样器。这都是20几年以前的事了。一般手进样也好，自动进样也好，都有一定的准确度。在认证的过程中自然可以得到。不过有一点我要强调，FDA强调的两点我们要注意。一是the best available technology，另外就是the best practical technology。目前的情形来看，自动进样符合了上面的两个条件。当然，如果手进样的结果与自动进样相当，当然可以用手进样。可是以后方法转移的时候可能会有问题。目前一般仪器都不错，尤其在做等度分离的应用。所以操作人员的训练就很重要了。这也是FDA，相信国内也是一样，一直强调人员的训练与合格化qualification的原因。至于标准曲线的相关系数，我想就是根据认证的结果。当然，假设我们用了一般的仪器，对我们的方法合理的认证后，所得到的结果就是我们对每一个认证参数的要求。这点非常重要。我不就提到过0.9999 及0.99999有啥不同。一位读友告诉我，就是可信度的问题。我是绝对同意的。
其实我一再重视的就是一些最基本的东西。不管那一门学问，把最基本的搞清楚了，自然可以入门。入门之后，才能慢慢的登堂入室。可惜，这些最基本的，往往被大家做忽略（在美国）。至少我的感觉是如此的。