液相流动相的选择-----------------------液相色谱柱法

流动相的选择液色迷人
2．流动相的选择
在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱。
正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。
反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但Snyder则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185~205nm处检测的要求，因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。
在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的k值并分离良好，也需采用梯度洗脱技术。
流动相的调节是搞液相分析最重要的环节，也是液相水平高低的度量，每一种液相都有影响它的主要因素，抓住主要因素，问题就容易解决。欢迎大家讨论。一则可以为新手传播知识，二则大家相互学习共同提高！液色迷人
先开个头：常用的是化学键合相色谱，分离中性化合较简单，主要是调节溶剂强度，可从有机相的比例合种类两个方面入手，例如：有机相占的比例大，出峰就早。分离酸碱化合物就就复杂一点，增加了添加剂，明白了添加剂的作用，然后从溶剂，酸碱性，添加剂等方面入手。问题就容易解决。
液相色谱采用键合硅胶可以分离绝大多数的分析物质，针对不同化学性质的单体采用不同的键合硅胶，现在有什么十八烷　、氨基柱、氰基、苯基太多了，再加上不同流动相也就是加入不同的抑制剂可以测许多成分，比如：酸性的可以用十八烷加入酸，加缓冲盐；碱性物质可以加缓冲盐，以个人来讲用离子对的形式较多，并且效果也很好，现在分析生物碱是比较难做的，我现在就有一个难题，就说盐酸水苏碱吧，在低波长的吸收，UV是不行了，用蒸发光检测器，但是分离又成了问题，我试了十八烷，氨基柱、氰基、都不理想，并且用过日本的shodex（C18）柱PH9-10不好。不好做呀，在郁闷中…………………   液色迷人
如用反相色谱柱时，一般先改变有机相与水相的比例；再考虑改变pH值，酸性物质将pH值调低，碱性物质将pH值调高；如两者都无效，可考虑加入离子对试剂，如庚烷磺酸钠用于（碱性药物）
我觉得溶剂过滤器抽滤时抽走一部分有机相使保留时间相差较大。
其实流动相的调节也是很难的，一个条件下来是非常的不易呀，从查文献到，条件成熟，有一次我做麻黄就是二个月呀，最后才定下来，现在的水苏碱又是一个大头，现在为什么生物碱这样的难做呢，柱前衍生我是考虑过，但对柱子是有影响的，同时处理也麻烦。
对于流动相的抽滤对测定是没什么影响的，一个稳定的条件，是不计较那一点损失的，如果抽滤对于测定的影响非常之大这个条件是不稳的。
现在的流动相在检验所比例是可调的，但酸碱不变，所以我个人认为在一定的比例范围内，耐用性一定要好。有高手的话对我的水苏碱给一点意见     液色迷人
一. 反相HPLC中的溶剂优化：1.首先应调整k’值：强溶剂→20％递减→选择合适的溶液强度，使得k’在1～20（tR：3～35min）。 一种方法是首先试用一种可能过强的流动相，在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以增大k’。当所有谱峰符合1＜k’＜20的范围时，从溶剂强度的观点来说，其流动相已接近最佳了。(观察待分离组分的分离度)。（反相色谱——溶剂极性弱洗脱能力强，组分k’减小）。另一种方法是首次用梯度洗脱试验。通过这一实验，有可能估计出使样品的k’值符合1＜k’＜20范围的大概溶剂成分。2.改变选择性(á)：根据分子间作用力将溶剂分组。不同组的溶剂选择性不同，根据溶剂分组改变溶剂种类即可改变选择性。
二. 离子对HPLC中的溶剂优化: 离子对色谱法是分离离子，或可电离的分子的一种色谱技术。关于离子对色谱的机理，至今仍不十分明确，但己提出三种机理：离子对形成机理，离子交换机理，离子相互作用机理。在以下讨论中，采用离子对形成机理。
① 基本原理：有一色谱体系，固定相为非极性，如C18型键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子相反的离子B+，B+离子由于静电引力，与带负电的组分离子生成离子对，故称它为平衡离子或成对离子。由于离子对具有疏水性，因而被非极性固定相(即有机相)提取。组分离子的性质不同，它与平衡离子形成离子对的能力大小不同，以及离子对的极性不同，导致各组分离子在固定相中滞留的时间不同，因而各离子先后离开色谱柱，这就是离子对色谱法的基本原理。以上这类色谱法称反相离子对色谱法。能用离子对色谱法分离的样品种类很多。它可以用于极性样品，如碱类、酸类、离子、以及带有可离解的多种官能团化合物的分离。可用于生理体液的分析，如甾族化合物以及体液中药物的分析。
反相离子对色谱中流动相的影响小结 ：1.改变选择性：a.改变溶剂种类: 改变溶剂选择性的方法，类似于键合相色谱所介绍的原则。选用不同选择性组别的溶剂，可使流动相的选择性得到明显改进。b.改变pH: 组分离子与平衡离子的生成，离子对的形成，都与流动相的pH值密切相关。改变流动相的pH可以改变体系的选择性。流动相的pH值应调节到能使不同组分有合适的离解度，而使提供平衡离子的化合物能完全离解。要符合这一要求，只有使提供平衡离子的化合物在一个很宽的pH范围内保持完全离解，因此，只有强酸盐(高氯酸盐或烷基磺酸盐)和强碱盐(季铵盐)才满足此要求。c.系统选择:使用一种有机溶剂(甲醇)；流动相的其它三种成分为pH=2.5(和pH=7.5的缓冲液以及另一种pH=5.5、其中含有最大浓度(例如：200mM)的离子对试剂的缓冲液(D)。以组合不一的缓冲液(B—D)进行七次实验，并变化甲醇(A)量以保持每次实验的k’值范围大致恒定。
三.正相HPLC中的溶剂优化
①溶剂
非极性溶剂：正己烷或FC-113（1,1,2-三氟-1,1,2-三氯乙烷）
极性溶剂：非定位、碱性定位和非碱性定位
按正相HPLC中谱峰间距效应分类的溶剂
取代和定位是正相HPLC流动相选择性的主要来源
②溶剂强度调节
③选择性影响
四、梯度洗脱
梯度洗脱给色谱分离带来很大的方使，已成为高效液相色谱法不可缺少的部分。所谓梯度洗脱，就是有两种(或两种以上)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续地改变，以改变流动相的配比和极性。通常用的流动相为二元的。
梯度期间，强溶剂B(如反相HPLC中的甲醇)的浓度增大。在下述讨论中，我们将这种溶剂的浓度写作 B％ 。
梯度洗脱对分离一定种类的样品很理想。可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。梯度洗脱对于复杂混合物、特别是保留值相差较大的混合物的分离是极为重要的手段。因为这些样品的k’范围宽，不能用等度方法简单地处置。
１．梯度洗脱期间的平均k’值
tR=tm(1+k’)
VR=Vm(1+k’)=Vm+kVs
我做液相时，为什么主峰总是出现肩峰？是柱效降低了还是制剂中的成分没有完全被分离出来？应该如何处理肩峰？
出现上述情况的原因，可能大致考虑以下几个方面：一、就是组分影响，也就是有与主峰保留时间相近的组分峰（杂质峰）的存在；二、柱子柱效明显降低，是柱子要坏掉的先兆；三、主药在流动相中发生部分离解，使一部分主药的结构状态发生改变。等。
解决方法，对应解之，即可。液色迷人
（个人见解）
各们讲的都很厉害啊，我是初学者不太了解。
但在操作中常要根据要分离的物质加适当的离子对试剂，
而离子对试剂是如何选择的呢？
我在做盐酸水苏碱时也遇到了楼上的问题，尝试了UV及ELSD，都不是很理想，最近看到有人用柱前衍生然后用UV，但自己没做过，不知效果怎样。但出于检测方法应该越简单越好真想快点找个即简便又有效的方法。
我也在做盐酸水苏碱，用的是SCX（离子交换柱）柱，出峰时间在8——9分钟之间，样品经处理后基线分离的比较好，唯一不好的就是峰型有些拖尾。因为它的流动项是缓冲溶液，所以调了一下配比，发现离子交换柱出峰并不象ODS柱那么有规律，随着pH的加大，峰对称性升高，峰宽减小，离子交换柱出峰有一明显波谷反而宽度增加，峰形变大。盐酸水苏碱标准品峰对称性最多只能达到0.58
不过还是比ODS柱出峰要好
针对做生物碱的朋友：
1. 用常规的ODS柱会出现一个最普遍的问题是：峰很宽，拖尾很严重！
原因：ODS柱有很多未键合的硅羟基，与N缔合造成。
解决方案：使用BDS柱，他是用碱钝化残余的硅羟基，很好的避免了拖尾现象！
2. 用常规的SCX离子交换柱会出现一个普遍的问题是：重现性差，随流动相的pH值大小，Rt变化大！
原因：所谓离子交换柱，就是阴阳正负离子的交换，由于流动相的离子浓度的变化，势必会影响交换平衡！
解决方案：流动相用Buffer缓冲液！
向各位老师请教，我做液相时出现了进空白，样品，原料都没有主峰的现象，过去做过这个，正常，请帮忙分析一下
补充一下，以前配流动相是乙腈与盐混合过滤，再超声，这次是先滤盐，后滤乙腈，再超声，这一步应没问题吧
我买的新的ODS碳18柱子,做白藜芦醇和它的苷,标样混标,出峰比较好.但是后几个点保留值提前,今天进样,发现有肩峰,但是保留时间基本一致.流动相是甲醇和水,40比60.怎么办呢
hu_2104411 wrote:
我买的新的ODS碳18柱子,做白藜芦醇和它的苷,标样混标,出峰比较好.但是后几个点保留值提前,今天进样,发现有肩峰,但是保留时间基本一致.流动相是甲醇和水,40比60.怎么办呢
可能是柱子脏了，用异丙醇或者四氢呋喃冲洗一下，柱子现在的压力比最初使用时高多少？
请问base-deactivated octadecylsilyl silica gel是什么柱？谢谢！
to ：xinyiaa
bds是填料经过碱基去活的ods,就是将硅胶表面的硅醇基碱性硅烷化,适合于弱碱性和弱酸性化合物. 对于某些色谱的分离较好。对于离子对色谱，有时不加离子对，分离也很好，峰的对称性也有很大改善，当然，其作用不止这些。可以当作普通的ods用，但价格较贵。
我接触液相刚一个月，做硕士课题，用液相分离血中的ATP,ADP,AMP,NAD,NADH,NADPh,NADP
条件：4.6*250，5um，流动相：磷酸钾缓冲液，0.05mol/l，ph6.0,甲醇10%
流速1.0ml/min
跟文献上的一样可是我的ATP,ADP出峰时间早了两分钟，而且两者根本分不开了，所有的原因都想到了可分离度还是很低。
另外，对标准品分离可以，但样品分不开，怎么解决呢？
来源  hplc培训教程IV - LCMSMS液质联用的日志 - 网易博客
流动相的选择- 液相色谱柱法的日志- 网易博客
所谓梯度洗脱，就是有两种(或两种以上)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续地改变，以改变流动相的配比和极性。通常用的流动相为二元的。
从乙腈的短缺说起
http://minglism.spaces.live.com/blog/cns!DE67542E151EED35!1231.trak
只要学过大学化学的人对乙腈（Acetonitrile，ACN，化学式：CH3CN）都应该不会陌生。乙腈相对弱的极性，出色的溶解能力，粘滞系数小，易挥发和低化学活性使得它成为一个最为常见的化学溶剂之一，特别是在色谱分离有机化合物方面（反相色谱分析，RPLC），乙腈和水组成的二元体系可谓是不二之选。以我所在的实验室为例，乙腈绝对是必不可少，简单来讲，如果实验室消耗第一多的溶剂是水，乙腈就当仁不让的排在了第二位。 毫不夸张的说，每时每刻仪器里面都流动着乙腈。然而，从今年10月开始，全球突然无预警的爆发了一场乙腈的短缺。（我也是前两天才知悉，有点圡......）到底有多短缺呢？举个例子好了，我们实验室在10月份的时候向Fisher定购了1箱乙腈，现在都十二月了，还是没货。据说，这一波短缺还将持续下去，乐观的分析说在明年一月底就会陆续好转，然而来自几个主要Vendor的内部消息说短缺会持续到明年第一季度末，那会是明年三月底了！！！可以想象的是在接下来的几个月内，很多实验室的运作会收到严重的影响。现在回想我三个星期前（当时我还没有得知这个全球性的短缺），我十分豪气的用了4升的乙腈，眼睛都没有眨一下。罪过啊，现在实验室库存的乙腈已经不到1升了，还要撑几个月，唉，越想越罪过......但是为什么突然会出现短缺呢？这说来话长了，还得从如何生产乙腈说起。生产乙腈有很多方法，但具有工业化效益的似乎就一两条工艺。先撇开Monsanto开发的高温高压下催化氨气和一氧化碳直接合成乙腈的“绿色化学”方法（非主流，市场占有比例小）不谈，最普及的工艺却是并不直接合成乙腈，而是在氨气氛围下直接氧化短链烯烃（好像是丙烯）合成丙烯腈的同时分离出这个反应的副产物之一：乙氰。对于这种工艺，乙腈可以回炉作为燃料来维持反应温度，也可以提纯出来作为独立的产品。而全世界绝大多数的工厂都采用回炉的方式消耗掉乙腈。在选择提纯乙腈作为产品销售的工厂中，又以美国德州的一个工厂（Ineos）和中国的工厂为主要供应商。所以乙腈本来的供应都不算富裕，特别是在北美市场。而2008年，奥运年，中央政府为了实现其绿色奥运的承诺，关闭和限产了很多化工厂，再加上出口退税政策的改变，乙腈出口骤减。据我猜测，今年年初由于燃料价格飙升，很有可能有些工厂也因此改变工艺，回炉了乙腈维持反应炉温度，从而达到减少燃料使用的目的。但是如果仅仅是中国大陆还不至于造成这么严重的短缺。今年九月，飓风艾克（Hurricane Ike）袭击了美国德州（美国最重要的乙腈生产基地），导致工厂设备严重受损，虽然现在已经恢复生产了，但是产能还是收到了一定的影响。这无疑对已经存在的市场短缺雪上加霜。但是奥运在八月，飓风在九月，都过了3个月了，为什么市场还是没有恢复正常呢？毕竟这两个问题都容易解决，只要改变政策（奥运已过），修好设备，一两个月就应该恢复正常。这就不得不说到最后一个原因了。这最后一个原因，我个人觉得是为什么这次的短缺会持续很长时间的最重要原因。那就是经济衰退。乙腈作为丙烯腈生产过程的一个副产物，其产量当然会收到丙烯腈工业的影响。然而丙烯腈是用来干什么的呢？作为石油化工的重要一环，丙烯腈（CH2CHCN）是生产塑料，橡胶，树脂等重要工业产品的单体原料。举一个简单例子好了，ABS树脂（Acrylonitrile butadiene styrene）就是由丙烯腈聚合而来，而ABS树脂可以用来干什么呢？你所能想象到的所有家电产品几乎都有ABS的踪迹：从电视机外壳，电话，冰箱内衬，到玩具，水管，球拍，汽车的内架、方向盘等......数不甚数。（扯远了，－_－'''）用脚趾头想都知道，经济衰退，丙烯腈需求减小，工厂减产丙烯腈，自然乙腈也产量自然也高不了。而且事实也是如此，一个主要生产丙烯腈的工厂已经决定在明年一月分停工2个星期，以节省开支。唉，综合分析，天灾，人祸，市场规律最终导致和决定了乙腈短缺的发生和将持续下去的事实。
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