肺岩宁方下调裸鼠人肺腺癌细胞移植瘤中磷酸化Akt和缺氧诱导因子1α蛋白表达

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肺岩宁方下调裸鼠人肺腺癌细胞移植瘤中磷酸化Akt和缺氧诱导因子1α蛋白表达
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                          作者:张铭, 徐振晔, 白冰, 董昀

【摘要】  观察肺岩宁方对人肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤中缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor1α,HIF1α)表达的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号调节的影响。方法:32只A549荷瘤裸鼠随机分为4组:模型组、顺铂组、肺岩宁方组和综合治疗(顺铂加肺岩宁方)组,每组8只。化疗组和综合治疗组于第1、3、5天腹腔注射顺铂各0.1 mg,肺岩宁方组和综合治疗组予肺岩宁方0.4 ml灌胃,持续21 d。观察抑瘤率,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RTPCR)检测移植瘤中HIF1α mRNA表达,免疫组化法检测移植瘤中HIF1α和磷酸化Akt(phosphorylated Akt, pAkt)蛋白表达。结果:肺岩宁方组裸鼠抑瘤率为34.17%,综合治疗组为64.38%。RTPCR结果显示,综合治疗组HIF1α mRNA的表达水平低于模型组(P<0.05)。免疫组化实验显示,化疗组、肺岩宁方组和综合治疗组移植瘤HIF1α蛋白表达均明显低于模型组(P<0.01);肺岩宁方组和综合治疗组pAkt蛋白表达明显低于模型组(P<0.05)。结论:益气养精法为主的肺岩宁方可抑制肺癌肿瘤生长,并与顺铂有协同作用。肺岩方对HIF1α蛋白表达的抑制作用可能与下调pAkt表达有关。

【关键词】  益气养精; 肺岩宁方; 人肺腺癌A549; 缺氧诱导因子1, α亚基; 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶; 裸鼠

      缺氧诱导因子(hypoxia inducible factors,HIF)是一类转录因子,HIF1α可以调节许多靶基因,促进肿瘤的血管生成、细胞增殖以及肿瘤转移等,磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)丝氨酸苏氨酸蛋白激酶中Akt信号的活化可使HIF1α蛋白合成增加[1]。肺岩宁方是徐振晔教授研制的具有防治肺癌侵袭转移作用的经验方,本研究旨在观察肺岩宁方对A549裸鼠移植瘤中HIF1α表达的Akt信号调节的影响,探求该方抑制肿瘤生长的可能作用靶点。

  1  材料与方法

  1.1  实验材料

  1.1.1  实验动物及细胞株 

  Balb/C裸鼠32只,雄性,8周龄,体质量(14±2)g,购于上海西普尔必凯实验动物有限公司,许可证号为SYXK(沪)20050002。饲养于上海中医药大学龙华医院实验中心SPF级动物房,室温25 ℃,湿度70%,自由进食与饮水。人肺腺癌细胞株A549购于中国科学院上海细胞生物学研究所。培养于含10%胎牛血清(fetal calf serum, FBS)的RPMI 1640的细胞培养基,37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养。

  1.1.2  实验仪器 

  DU800紫外分光光度仪购于美国Beckman公司,TGradient聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR)仪购于德国Biometra公司,凝胶成像分析系统购于美国Alpha公司。

  1.1.3  主要药材和试剂 

  肺岩宁方由生黄芪、白术、七叶一枝花、蜂房、黄精、山萸肉、仙灵脾和灵芝等组成,由龙华医院中药房提供。常规水煎,浓缩至生药含量为2.0 g/ml,4 ℃保存。顺铂(diamminedichloroplatinum,DDP),20 mg/瓶,齐鲁制药厂产品,批号为04090352。RNA提取液TRIzol为北京天为时代科技公司产品,逆转录(reverse transcription, RT)反应试剂盒为上海晶美生物工程有限公司产品,AmpliTaq DNA聚合酶为上海生物化工有限公司产品,兔抗人HIF1α和磷酸化Akt(phosphorylated Akt, pAkt)单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品,免疫组化SP试剂盒为美国Zymed公司产品。

  1.2  实验方法

  1.2.1  动物模型制备及给药 

  A549细胞悬液0.1 ml(含细胞数目5×106个),注射于裸鼠右腋部皮下。裸鼠按随机数字表法分为模型组、DDP组、肺岩宁方组和综合治疗组(DDP+肺岩宁方),每组8只。2周后观察到裸鼠皮下有小结节长出,成瘤率100%,开始给药,给药剂量根据人鼠体表面积折合法计算。模型组:生理盐水0.4 ml灌胃21 d。化疗组:第1、3、5天DDP溶液(20 mg DDP溶于200 ml生理盐水)1 ml(含DDP 0.1 mg)腹腔注射。肺岩宁方组:中药0.4 ml(含生药0.8 g)灌胃21 d。综合治疗组:第1、3和5天DDP溶液1 ml腹腔注射,中药0.4 ml(含生药0.8 g)灌胃21 d。停药后次日,处死裸鼠,剥取瘤块,称质量后切取部分肿瘤组织,置于10%中性福尔马林液中固定,48 h内常规石蜡包埋。取余下标本-70 ℃冻存,用于检测。

  1.2.2  观察指标

  1.2.2.1  抑瘤率 

  抑瘤率=(空白对照组平均瘤质量-实验组平均瘤质量)/空白对照组平均瘤质量×100%。

  1.2.2.2  RTPCR检测肿瘤组织中HIF1α mRNA表达 
  采用TRIzol一步法提取总RNA,在RT反应体系中按照试剂盒说明进行逆转录反应,PCR扩增参照试剂盒说明,引物由上海生物化工有限公司合成。内参照磷酸甘油醛脱氢酶( glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)上游引物:5’ACA GCC GCA TCT TCT TGT GCA GTG3’;下游引物:3’GGC CTT GAC TGT GCC GTT GAA TTT5’。扩增片段长度174 bp。HIF1α上游引物:5’ACA AGT CAC CAC AGG ACA G3’;下游引物:3’AGG GAG AAA ATC AAG TCG5’。扩增片段长度168 bp。反应条件为:GAPDH,94 ℃变性,52.2 ℃退火,72 ℃延伸,25个循环;HIF1α,94 ℃变性,49 ℃退火,72 ℃延伸,34个循环。在紫外光凝胶成像分析系统下摄片,检测扩增片段灰值,以HIF1α基因片段与GAPDH片段灰度值的比值作为其相对表达水平数值。

  1.2.2.3  免疫组化法检测HIF1α和pAkt蛋白表达 
  免疫组化法检测各组肿瘤组织中HIF1α和pAkt蛋白表达,操作步骤参照试剂盒说明书进行。图像分析采用CMIAS多功能真彩色图像分析系统。每张切片随机采样测量4处,计算单位面积下阳性染色区域面积。