DNA序列分析与PCR-SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

DNA序列分析与PCR-SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

摘要:目的　了解DNA序列分析与PCR-SSCP法分析利福平敏感性的价值。方法　应用DNA序列分析与PCR-SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株25株、耐药株41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况。结果　医学论文范文http://020lunwen.com/guangdongmianfeilunwen/25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变,41株耐利福平株中38株发生突变,突变率为92.7%(38/41);25株利福平敏感的结核分支杆菌菌株PCR-SSCP带型与对照H37Rv株相同,41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP带型不同于对照株,提示有突变存在。与DNA序列分析比拟,PCR-SSCP检测正确率为93.9%(62/66),敏感度为92.1%(35/38);特异度是96.4%(27/28)。

结论　DNA序列分析对判定结核分支杆菌耐利福平非常有价值;PCR-SSCP可用于利福平耐药结核分支杆菌的初步筛选。

枢纽词:DNA序列分析;聚合酶链反应-单链构象多态性;药物耐受性;分支杆菌,结核

Comparison of DNA sequencing andsingle-strand conformation polymorphism methodsfor identification of rpoBmutations in rifampin-resistant isolates ofMycobacterium

Abstract:Objective　To evaluate the significance of DNAsequencing and PCR-SSCP in suscepti-bility analysis ofM.tuberculosistorifampin.Methods　Analyzed thesusceptibility to refampin of 25 ri-fampin-sensitive and 41 rifampin-resistantclinical isolates ofM. tuberculosisby DNA sequencing andPCR-SSCP.Results　No mutation was found in 25rifampin-sensitive strains by DNA sequencing.while38 of 41 rifampin-resistantstrains had mutations in rifampin resistant determination region (RRDR)ofrpoBgene,the mutation rate was 92.7%(38/41);25 rifampin-sensitive strains hadsame PCR-SSCPgel profile withM.tuberculosisH37Rv,while 38 of 41rifampin-resistant strains showed different SSCPprofile that coulddifferentiate its from control,indicating the possible existence of sequencealterations inthe region ofrpoBgene.The accordance rate of DNA sequencing andPCR-SSCP was 93.9%(62/66),compared with DNA sequencing,the sensitivity ofPCR-SSCP was 92.1%(35/38),the specialty ofPCR-SSCP was 96.4%(27/28).Conclusion　DNA sequencing is valuable inrifampin susceptibilitytest;PCR-SSCP is useful in rifampin resistance strains screening.

Key words:DNA sequencing;PCR-SSCP;Drugresistance;Mycobacterium tuberculosis　

　耐药题目是结核病化疗中的挫折,也是结核病控制面对的难题之一。了解结核病人耐药情况,是　建立公道有效的抗结核化疗方案的必要前提;建立一种快速、可靠的耐药分析方法,是结核病防治确当务之急。利福平是利福霉素的半合成衍生物,通过与细菌RNA聚合酶β亚基结合,按捺转录起始复合物形成,干扰细菌的转录过程,实现其杀菌效果。它是结核病短程化疗的基石,利福平耐药是结核病化疗失败的常见原因。早在20世纪80年代就发现结核分支杆菌和麻风分支杆菌对利福平的耐药性与细菌的DNA突变有关,这种突变集中于细菌RNA聚合酶的β亚基的编码基因rpoB中,已发现约96%(315/329)的无流行病学联系的耐利福平临床株在rpoB基因81个碱基的核心区域—利福平耐药决定区(rifampin resistantdetermination region RRDR)有突变。本研究利用DNA序列分析与PCR-SSCP两种方法检测利福平的耐药相关基因rpoB基因核心的突变情况,以了解这两种方法分析结核分支杆菌利福平敏感性的价值。材料和方法

一、材料1?菌株来源:结核分支杆菌H37Rv尺度株来源于中国药品生物制品检定所;耐利福平结核分支杆菌临床分离株41株,敏感株25株来源于卫生部结核病控制中央和解放军全军结核病控制中央。根据“结核病诊断细菌学检修规程”进行菌种鉴定和药物敏感性试验。受检的66株临床分离菌株经鉴定均为结核分支杆菌。

二、方法1?细菌DNA制备:结核分支杆菌临床分离株在L-J鸡卵培养基上37℃培养4周,分别刮取菌落磨匀,以1×TE液悬浮。用煮沸法破壁提取分离DNA。2?DNA序列分析:(1)PCR反应:上游引物P15′GAGCGGATGACC ACC CAG G3′;下游引物P25′CAG GAA GGGAAT CAT CGC GG3′。扩增DNA片断长度为588bp。反应参数如下:95℃预变性5min,94℃变性1min,60℃复性1min,72℃延伸1min,35个轮回。最后一步72℃延伸10 min。(2)PCR产物纯化:PCR产物经琼脂糖电泳后,用QIA-GEN公司DNA胶回收试剂盒(代号28704)回收DNA片断。(3) DNA序列分析:应用PE公司ABI373自动测序仪、Amersham Phamacia公司测序试剂盒(DYEnamicET Terminator CycleSequencingPremix Kits US81050)。3?PCR-SSCP:(1)PCR反应:PCR引物2A 5′CGGATGACCACCCAGGAC;引物2B 5′GGTTTCGATCGGGCACAT。扩增片断长258 bp。反应参数:95℃预变性5 min,94℃变性1 min,61℃复性1min,75℃延伸1 min,30个轮回。最后一步72℃延伸10min。(2)DNA单链构象多态性分析(SSCP):配制8%非变性聚丙烯酰胺凝胶,待凝胶后,预电泳30min。5μl基因扩增产物加入等体积甲酰胺变性液混匀,95℃预变性10 min,立刻冰浴5 min。样品加入凝胶孔中,在6℃、100 V电压下电泳2~3h。凝胶板银染法染色。(3)观察结果:以结核分支杆菌H37Rv的SSCP聚丙烯酰胺凝胶的谱型为对照,被试菌株的谱型与其相同者被判为SSCP阴性(即无突变),相反,则判为阳性。结　　果一、DNA序列分析结果25例利福平敏感株未检测到rpoB基因突变,41株耐利福平临床分离结核分支杆菌菌株中38株检测到突变,突变率为92.7%(38/41),其中34.1%(14/41)突变位于531位氨基酸,17.0%(7/41)突变位于526位氨基酸,突变情况见表1。

表141株耐利福平临床分离结核分支杆菌菌株基因突变情况突变位点株数突变发生率(%)53114 34.1526 7 17.0516 3 7.3其它14 34.1无突变3 7.3

二、PCR-SSCP结果25例利福平敏感结核分支杆菌菌株未检测到突变。41株耐利福平结核分支杆菌临床分离株中38株检测到突变。

三、DNA序列分析法和PCR-SSCP法检测66株结核分支杆菌临床分离株rpoB基因突变检测结果比较(表2)。图1　

结核分支杆菌临床分离株rpoB基因258bp扩增产物SSCP电泳图1~5—耐利福平结核分支杆菌临床分离株;6—利福平敏感株;7—H37Rv尺度株。1、5、6、7—SSCP(-),2、3、4—SSCP(+)表2　66株结核分支杆菌临床株DNA序列分析法和PCR-SSCP法检测结果比较SSCP(+) SSCP(-)总数序列分析(+) 35 3 38序列分析(-) 1 27 28总和36 30 66

讨　　论我国的结核病耐药率高,临床医生在确定抗结核治疗方案时必须考虑有无耐药存在,这不仅关系到化疗的成败,而且对结核病的控制也至关重要。传统的耐药性测定方法需时过长,如何实现快速的药敏分析,是结核病控制中备受关注的题目。DNA序列分析是一种快速而客观的检测方法,但因为涉及昂贵仪器而限制了这一方法的广泛应用。聚合酶链反应-单链构象多态性(Single Strand ConformationPoly-moephism SSCP)是检测点突变的比较成熟的方法[1~2],80年代起已在海内结核病耐药检测研究中得到应用。因为其具有简朴、经济、快速、无需特殊仪器的特点[3~5],尤其合用于我国的实际状况。过去的研究多以罗氏培养药敏结果作为对照,未能针对PCR-SSCP用于检测点突变的特点对其进行评价。本研究将DNA序列分析结果作为参照尺度,评价PCR-SSCP检测rpoB基因突变的敏感性和特异性。本研究通过DNA序列分析,检测到耐利福平的结核分支杆菌中有92.7%的菌株存在rpoB基因突变,与国外报道一致[6]。突变中以531位和526位氨基酸最为常见,突变发生率分别为34.1%和17.0%,也与国外报道相符。另外一个在部门国家和地区较常见的突变位点516的突变发生率为7.3%(3/41)。DNA序列分析固然有客观可靠的长处,但因为5%~10%的利福平株并无rpoB基因突变,因而DNA序列分析检测耐药情况尚不能发现全部耐利福平菌株;而且已发现的突变与细菌发生耐利福平间的关系还有待进一步印证。因此,若想利用DNA序列分析数据判定临床结核分支杆菌利福平敏感性,尚需对已发现的大量的序列改变的性质和作用进行详尽研究和客观评价。利用PCR-SSCP法检测的258bp的rpoB基因片断包含于DNA序列分析的588 bp片断中。本研究41株受试耐利福平菌株中有38株检测到的带型与尺度株不同,提示可能存在rpoB基因突变,3株泳动带型与尺度株H37Rv相同。PCR-SSCP法检测的41株耐利福平菌株中有37株的检测结果与DNA序列分析相同,若以DNA序列分析为尺度,那么PCR-SSCP的检测正确率为93.9%(62/66),敏感度为92.1%(35/38),特异度是96.4%(27/28),假阳性率3.6%(1/28),假阴性率为7.9%(3/38)。这说明PCR-SSCP法检测rpoB基因突变的敏感性和特异性接近DNA序列分析,对于辅助检测利福平药敏情况非常有价值。本实验中有3株细菌DNA序列分析检测到突变,而PCR-SSCP却未发现突变,这3株突变位于531Ser (TCG→TTG)、526His(CAC→CGC)和532Ala(GCG→GTG),而本研究中存在上述突变的其它菌株,PCR-SSCP检测却得到阳性结果。还有1株细菌DNA序列分析未检测到突变,但PCR-SSCP却得到与尺度株不同的带型。这些结果很难用现有的理论解释。Lee等[7]曾比较PCR-SSCP法和DNA序列分析法检测rpoB基因突变的情况,发现25.4%(17/67)的耐利福平临床分离株在PCR-SSCP试验时电泳带型与敏感对照株带型无异,而测序又确实发现在其rpoB基因易突变内存在基因突变。由此可以推测,一些耐利福平的菌株可能通过某种分子机制影响PCR-SSCP分析结果,使其呈现出与利福平敏感对照株相同的电泳带型。显然,并非某一位点上的某一种突变造成这种假象,由于DNA序列分析结果并未发现有这样位点的存在。与PCR-SSCP比拟,序列分析是一种比较客观而可托的检测方法,所以也不能排除在PCR-SSCP实验的操纵过程中存在某些失误,造成了实验结果的假阴性和假阳性。因为存在假阳性和假阴性题目,PCR-SSCP法的结果只能作为临床判定耐药情况的参考,考虑到其具有敏感性高和特异性强的特点,因而可用于临床上耐利福平的病人的初筛。另外,据报道少数耐利福平临床分离株在利福平耐药决定区存在同义突变(synonymousmutation),这必然会影响单纯通过PCR-SSCP结果判断利福平敏感性的可靠性,但从总的趋势看,即使存在上述题目,PCR-SSCP仍不失为临床辅助耐药性诊断的好方法。

参考文献: http://www.020lunwen.com/guangdongmianfeilunwen/yixuelunwenfanwen/20101217517.html

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