核酸的纯化的全文

核酸的纯化
在分子克隆的所有操作中，最基本的操作也许要算核酸的纯化了。其关键步骤是去除蛋白质，通常只要用酚：氯仿抽提核酸的水溶液即可。每当在进行下一步操作之前需要把这一步克隆操作所用的酶灭活并去除时，都可采用这种抽提的方法。然而如果要从各种复杂分子的混合物如细胞裂解液中纯化核酸，则需一些附加办法。在这些情况下，通常是在有机溶剂抽提之前先用某些蛋白水解酶去掉大部分蛋白质，这些广谱的蛋白水解酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K .
用酚：氯仿抽提
从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法是先用酚：氯仿(可含有0.1%的8-羟基喹啉)抽提后再用氯仿抽提。这个方法的好处是使用两种不同有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。此外，酚虽能有效地使蛋白质变性，却不能完全抑制RNA酶的活性，酚还能溶解带有长poly(A)的RNA分子(Brawerman et al.1972)。用酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)混合液抽提能够使这两个问题同时得以解决。随后用氯仿抽提则可去除残留在核酸制品中痕量的酚。通过乙醚抽提去除酚已广泛沿用多年，看来在目前的常规操作中已不必要或者不推荐使用。
(1)将样品转移到一只聚丙烯离心管中，加入等体积的酚：氯仿。
如果酚未被充分平衡至pH值为7.8-8.0，核酸将趋于分配到有机相。
(2)混合管中的内容物使之成为乳浊液。
(3)室温下用离心管可承受最大转速的80%的速度离心1min，若有机相与和水相不能充分分开，延长时间重新离心。
一般情况下水相处于上层，然而当水相中盐浓度(>0.5mol/L)或蔗糖浓度(>10%)过高而密度较大时，水相可能会在下层。由于在平衡酚时加了8-羟基喹啉(见附录1)，其黄颜色可使有机相易于辨别。
(4)用移液管把水相转移到另一离心管中，体积较小(<200ul)时可用带一次性吸头的自动移液器操作。弃去两相间的界面层和有机相。
为了获得最高的收率，可按下法对有机相和介面层进行“回提”：按上述方法第一次移出水相后，在剩余的有机相和介面层中加入等体积TE(PH7.8)，充分混匀，按第3步离心分离两相，合并两次得到的水相，继续按第5步操作。
(5)重复1～4步，直55有机相和水相之间的界面上看不到蛋白质。
(6)加入等体积的氯仿并重复2～4步。
(7)用乙醇沉淀的标准方法回收核酸。
偶尔也使用乙醚
[注]有机相与水相的混合，在分离小分子DNA(<10kb)时可使用旋涡混合器，分离中等大小DNA分子(10--30kb)时可轻轻摇动，而当分离大分子(>30kb)时则须注意以下事项，以避免对DNA的剪切作用 .转鼓上缓慢转动(20r/mm)离心管，使有机相与水相混匀。
ii将DNA从一管转移到另一管时应使用大口径吸管。
关于酚(C6H6O，F.W.=94.11)抽提的历史小记
直到20世纪50年代，纯化DNA的标准操作方法还是用去污剂和强盐(如高氯酸盐)溶液从蛋白质上脱下核酸，最终去除蛋白是用含有异戊醇的氯仿多次抽提实现的(Sevag 1934，Sevag et al.1938)。利用酚纯化核酸是Kirty首次报道的(1956)，这时他得知酚具有从水相中抽提蛋白的能力(Grassmann and Definer 1953)。在Kirty最初的论文中，是用酚—水两相混合液在室温下提取哺乳动物匀浆，结果RNA分配到了水相，而DNA结合在蛋白上留在两相界面上。Kirty很快意识到用阴离子盐的溶液代替水就能将RNA和DNA同时释放到水相(Kirty 1957，综述见Kirty 1964)。用阴离子盐从DNA中释放蛋白质的方法很快被废弃，而代之以SDS等强阴离子去污剂。尽管如此，Kirty最初描述的酚抽提法奠定了今天常用的许多纯化方法的基础。酚的作用可能与蛋白质溶剂相同，可以把阴离子盐或去污剂从核酸上解离下来的蛋白质抽提出来。这个过程如此高效，以至于仅仅经过两三次酚抽提就能得到纯的核酸制品。
纯酚的比重为1.07，因此在与水混合时应处于下层。然而有机相和水相会难于分开，甚至当从溶质浓度较高的水相中抽提蛋白时会发生两相颠倒的情况。若使用50:50的酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重较大(1.47)，可在很大程度上解决这个问题，促进两相的分离。变性蛋白一般集中在两相之间的界面层，而脂类则有效地分配在有机相中。一般在酚：氯仿混合物中加一些异戊醇以减少泡沫的产生。
纯的酚为白色结晶状(mp为43℃)，但酚暴露在空气和光线下会趋于变红，碱性条件能够加速这种变化。不主张使用结晶酚，因为结晶酚必须在182℃下重蒸去除诸如醌类等氧化产物，这些物质能够引起磷酸二酯键断裂或促进核酸交联。
许多供应商提供的液态酚含有大约8%的水，可于-20℃冷冻保藏。液化酚若为无色可不经蒸馏用于分子克隆。现在只有偶尔批次的液态酚会呈粉色或黄色，可拒收这些产品，退回厂家。
酚在使用前必须用水饱和并用Tris平衡至pH>7.8，以防DNA分配到有机相，这种情况在酸性pH下会
发生。
点滴透析
低分子质量杂质能抑制限制酶的消化作用或妨碍DNA测序，可通过点滴透析从溶液中除去这些杂质。
(1)在Millipore SeriesV膜(0.025 pm)上涂一滴(约50ul)DNA，在10cm直径的 Petri培养皿中内盛10ml无菌水，将膜的光亮面朝上漂浮在水上。
(2)使DNA透析10min。
(3)将液滴转移到一只干净的微型离心管中，从透析的DNA中取一小份进行限制酶消化及DNA测序。
核酸的浓缩
注意：在注有{!)处材料的正确使用参见附录12。
乙醇沉淀
乙醇沉淀是从水溶液中回收核酸的标准方法。该方法具有快速、简便、高效的优点，亚毫微克量的DNA和RNA可由乙醇定量地沉淀下来。然后可通过离心收集，并在数分钟内重新溶解。
乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na+之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。最常用的阳离子，见表A8-1及以下的叙述。
表A8-1 盐溶液
盐类
贮存液/(mol/L)
终浓度/(mol/L)
醋酸铵
10.0
2.0-2.5
氯化锂
8.0
0.8
氯化钠
5.0
0.2
醋酸钠
3.0(pH5.2)
0.3
(1)醋酸铵常用于减少多余的杂质(如dNTP及多糖)与核酸的共沉淀。例如在2mol/L醋酸铵存在下连续两次DNA沉淀可从DNA制品中除去>99%的dNTP(Okayama and Berg 1982)。在通过琼脂糖酶消化琼脂糖之后沉淀核酸时，使用醋酸铵也是最佳选择，这种阳离子可减少寡糖消化产物共沉淀的可能性。然而若用沉淀的核酸进行磷酸化时，就不要用醋酸铵沉淀核酸，因为铵离子能抑制T4噬菌体多核苷酸激酶。
(2)氯化锂常用于需高浓度乙醇进行的沉淀(如沉淀RNA)。LiCl在乙醇溶液中的溶解度很高而且不随核酸共沉淀。小分子RNA(如tRNA及5SRNA)在高离子强度下(没有乙醇时)是可溶的，而大分子RNA则不溶。可以利用这个差异在高浓度LiCl(0.8mol/L)中纯化大分子RNA。
(3)氯化钠 (0.2mol/L)用于DNA样品中存在SDS时。这种去污剂在70%乙醇中仍为可溶。
(4)醋酸钠 (0.3mol/L，pH 5.2)在DNA和RNA的常规沉淀中最为常用。
直到几年前，常规的乙醇沉淀还是在低温下(如在干冰—甲醇浴中)进行，现在知道这并无必要。在0℃且没有载体存在的情况下，即使浓度低至20ng/ml的DNA也能形成沉淀，并可在微型离心管中通过离心定量地加以回收。然而在沉淀低浓度的DNA或很小的片段(长度<100核苷酸)时，则需延长离心时间，使核酸沉淀更紧密地附着在离心管上。在没有载体存在的情况下，于100000g离心20～30min可回收到皮克级的核酸。
在处理少量DNA时，一种谨慎的做法是留下是每一步操作中含乙醇的上清液，直到把所有DNA回收回来。在用70%乙醇洗涤DNA沉淀时这种留样的做法尤为重要，因为洗涤过程往往使沉淀在管壁上的DNA变松散。
DNA沉淀的溶解
直到几年之前，回收的DNA沉淀在溶解以前还是经过真空干燥。这种做法现已废弃，这是因为：①干燥的DNA沉淀溶解缓慢且效率较低；②双链小分子DNA(<400bp)在干燥时会变性，原因可能是在干燥过程中失去了起到稳定作用的结合水分子外层(Svaren et al.1987)。
目前最好的办法是通过轻轻吸气移出DNA沉淀和离心管边缘上的乙醇，在实验台上敞口放置约15min挥去残余的乙醇，当DNA沉淀仍有些潮湿的时候用适当缓冲液溶解便可溶得快速而且完全。必要时可将重溶了DNA的离心管敞口放在45C加热块上保温2～3min挥尽残留的乙醇。
固定角度转头离心所得的DNA沉淀不一定都在离心管的底部。例如，在使用微型离心管的情况下，至少40%的DNA沉淀是贴在管壁上。为了提高DNA的回收率，可用吸枪头带动溶剂的液滴在管壁适当部位来回滚动数次。如果DNA样品具有放射性，可在移出溶解的DNA之后加以检测确定检不出残留的放射性。
载体
载体(或共沉淀剂)是在乙醇沉淀中用来提高少量核酸回收率的一种惰性物质。载体不溶于乙醇，形成的沉淀能够捕获目标核酸。离心时，载体能够产生可见的沉淀，有助于对目标核酸的操作。这大概是载体的主要优点。如上所述，乙醇沉淀效率极高，即使对于稀溶液中的少量核酸仍是如此，载体除了为目标核酸提供可见的线索之外并起不到多少实际作用。常用的载体有三种：酵母tRNA、糖原及线状聚丙烯酰胺。它们各自的优缺点列于表A8-2。
表A8-2 载体
载体
工作浓度
优缺点
酵母tRNA
10-20ug/ml
酵母tRNA比较便宜，缺点是沉淀的核酸若用作多核苷酸激酶或末端转移酶的底物时则不能选用。酵母RNA的末端是这些酶的良好底物，将与目标核酸的末端发生竞争
糖原
50ug/ml
糖原常用在用0.5 mol/L醋酸铵和异丙醇进行沉淀的场合。糖原不是核酸，因此不会在以后的反应中与目标核酸竞争。但糖原能够干扰DNA和蛋白质之间的相互作用(Galliard and Strauss 1990)
线状聚丙烯酰胺
10-20ug/ml
线状聚丙烯酰胺是一种有效的中性载体，可用于皮克级核酸的乙醇沉淀或蛋白的丙酮沉淀(Strauss and Varshavsky 1984，Gaillardand Strauss 1990)。
历史小记
乙醇沉淀的方法比分子克隆的出现要早大约50年，这种方法最早是J.Lionel AUoway用来浓缩生物活性核酸。Alloway于20世纪30年代早期在洛克菲勒学院工作，他计划由S型肺炎链球菌制备能够在体外转化R型菌株的无细胞提取物。那时转化还只是通过加热灭活的完整细胞实现的。经过多次挫败之后，他在1932年报道能够把起转化作用的物质转移到溶液中，其做法是将冻融的s型菌株提取物加热到60℃，通过离心去除颗粒物，再将溶液通过多孔陶瓷滤器过滤(Alloway 1932)。上述最后一步操作的目的是为了消除这样一个疑虑，即转化是由提取过程中偶尔存活的s型菌株所造成的假象。
Alloway不用加热致死的供体细胞实现了转化，这一成功在走向最终发现DNA是转化物质的道路上迈出了一大步(Avery 1944)。然而并不是Alloway制备的所有无细胞提取液均有转化作用，即使有转化作用的制备物转化效率也很低。可能Alloway意识到这个问题由于提取物的浓度太稀的缘故，他开始寻找各种裂解肺炎球菌的途径以及浓缩转化活性物质的方法(Alloway 1933)。MaClyn McCarty(1985)这样描述了Alloway发现乙醇沉淀方法的过程：
这时Alloway采用了一种新的方法，这个方法从此成为所有有关转化物质研究工作中不可缺少的操作方法。他加入5倍于提取物体积的纯乙醇时，结果从肺炎球菌释放出来的大部分物质都沉淀下来……。沉淀物能重新溶于盐溶液，并通过转化实验证实其中含有转化活性物质，乙醇沉淀和重新溶解可以任意重复而未引起活性丧失。
当然Alloway并非用乙醇沉淀核酸的第一人，这个方法已被几代为DNA碱基结构所困惑的有机化学家们在纯化步骤中采用。Alloway却是用乙醇沉淀制备能够改变受体表型物质的第一位科学家。最终证实转化因子是DNA还延迟了十多年时间，但应该公正地承认Alloway是今天我们已经习以为然的一项操作技术的发明者。
在微型离心管中乙醇沉淀的标准方法
(1)估计DNA溶液的体积。
(2)调整单价阳离子的浓度。若DNA溶液中含有高浓度的盐，可用TE(pH8.0)稀释，否则加入表A8-1列出的一种盐。
如果DNA溶液的体积不超过400ul可在单个微型离心管中进行沉淀，体积较大时可分成数管，或者在适宜于中速离心或超离心的离心管中进行离心。
(3)充分混匀溶液，准确加入2倍体积的冰冷乙醇，再充分混匀溶液。将此含乙醇的溶液置冰上使DNA沉淀形成。
一般放置15-30min就足够了。但如果DNA分子太小(小于100个核苷酸)或者DNA的含量太低(低于0.1ug/ml)则需把在冰上放置的时间延长到1h以上并加入MgCl2至终浓度0.01mol/L。DNA可在含乙醇的溶液中于0℃或-20℃无限期地保存。
(4)于0℃离心回收DNA。
在多数情况下于最大转速离心10min就足够了。然而如以上所述，在沉淀低浓度DNA(低于20ng/ml)或非常小的片段时则需要延长离心的时间。
手持打开盖子的微型离心管成一定角度，使沉淀物在上侧，将一个一次性吸头连至真空管道，从管内抽吸液体。把吸头置于离心管下侧，恰好在液体的凹面以下。随着液体的吸出，可将吸头移向管底。抽吸要温和，以免沉淀吸入吸头，并应使吸头的尖部离开沉淀。最后吸尽附着于管壁的液滴。
(5)用自动微量移液器或连于真空管道的一次性吸头(见图A8-2)小心移出上清液，注意不要扰动沉淀(有时沉淀是看不见的)。用吸头吸尽附于管壁的所有液滴。在沉淀比较珍贵的DNA样品时，最好暂时留存上清液，直至确定已回收到沉淀的DNA后再废弃。
(6)加半管70%乙醇，于4℃以最高转速离心2min。
(7)重复第5步。
(8)将离心管于室温下敞口放置在实验台上，直至残留的液体挥干。过去常用冻干机干燥沉淀，这一步不仅没有必要，而且也不适当，因为这样会引起小片段DNA(小于 400个核苷酸)的变性(Svaren et al，1987)，还大大降低大片段DNA的收率。
(9)将DNA沉淀(沉淀常常是看不见的)重新溶解于适当体积的缓冲液(一般为pH 7.6-8.0的TE)，用缓冲液充分漂洗管壁。
[注]i在微型离心管中离心之后，并非所有DNA沉淀都沉积在管底，沉积在管壁的DNA最多可达50%。为了回收到所有DNA，应使液滴在管壁的适当部位来回滚动，可用微量加液器上的一次性吸头推动液滴。
ii可用1倍体积的异丙醇
iii一般用乙醇从溶液中沉淀出来的DNA重溶于低离子强度的缓冲液如TE(pH8.0)中比较容易，偶尔在用含MgCl2或浓度高于0.1mol/L Nacl的缓冲液直接溶解DNA沉淀时可能要遇到一点困难。因此最好是先用少量低离子强度的缓冲液将DNA溶解后再调节缓冲液的成分。若样品不易溶于较小体积的缓冲液，可用多一些缓冲液溶解，再重新用乙醇沉淀。第二次沉淀有助于去除多余的盐及可能妨碍DNA溶解的其他成分。
用乙醇沉淀RNA
RNA可以用含2.5-3.0倍体积的乙醇从含有0.8mol/L LiCl、5mol/L醋酸铵或0.3mol/L醋酸钠的溶液中有效地沉淀下来。选择上述哪一种盐要取决于其后RNA的用途。由于十二烷基硫酸钾盐的极难溶，若要将沉淀得到的RNA溶于含SDS的缓冲液(如用寡聚dT-纤维素层析时就使用这种缓冲液)则应避免使用醋酸钾。同样，如果RNA已溶于含有SDS的缓冲液中，沉淀时也不要用醋酸钾。
[注]用于沉淀RNA的溶液应是无RNA酶的(见第7章)。
用氯化锂沉淀大分子RNA
小分子RNA(如tRNA和5SrRNA)在离子强度高的溶液中可溶，而大分子RNA(如rRNA和mRNA)则不溶，可通过离心沉淀下来。
(1)测量样品的体积，加0.2倍体积无RNA酶的8mol/L LiCl，充分混匀，置冰浴中至少2h。
(2)于0℃以15000g离心20min，弃上清，将沉淀下来的大分子RNA重溶于0.2倍体积水中。
(3)重复1和2步。
(4)用2倍体积乙醇沉淀，从重悬的沉淀物中回收大分子RNA。
用微量浓缩器进行核酸的浓缩及脱盐
除乙醇沉淀外，超滤也是核酸溶液浓缩和脱盐的一种可供选择的方法。这种方法不需要相的变化，在处理低浓度核酸时特别有用。Millipore公司供有一种称为Microcon滤筒的离心超滤装置，可以有效地进行核酸的脱盐和浓缩。下述方案及加注采自Millipore公司的网站(WWW.millipore.com)，详细说明可从该网站上查找。
(1)选择一种型号的Microcon，其核苷酸截留值等于或小于待分离核酸的大小(见表 A8-3)。
(2)如图A8-3所示，从提供的两只小管中取出一只，将Microcon滤筒插入其中。
(3)浓缩时(不影响盐的浓度)，可移取最多达500ul的样品(DNA或RNA)加到样品池中，按说明书推荐的时间离心，转速不要超过表A8-3列出的离心力。
(4)若进行盐的交换，加适量适当的稀释液，使浓缩样品的体积至500ul。按说明书推荐的时间离心，转速不要超过表A8-3列出的离心力。欲使盐的浓度更低，必要时可重复整个步骤。见表A8-3的脚注。
重要：样品池不要加得太满。
(5)从小管上取下样品池，倒置插入另一只小管中(在分析样品之前要留存滤液)。
(6)在一只微型离心管中于500—1000g离心2min回收小管中的核酸。
(7)取下样品池，盖紧管盖保藏样品。
图A8-3 用Microcon超离心进行核酸溶液的浓缩及脱盐
表A8-3 微型浓缩gSMic忱on的核苷酸截留值
Microcon型号
颜色标志
核苷酸截留值*
建议最大离心力(xg)
离心时间/min
SS
DS
4℃
25℃
3
黄
10
10
14000
185
95
10
绿
30
20