Biospin质粒DNA小量提取试剂盒检测

一、基础知识
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
二、实验目的
1，掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
2，检测该商品是否合格。
三、实验原理
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增→收集和裂解细胞→分离和纯化质粒DNA。
采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,简称cccDNA)的两条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
四、材料、设备及试剂
材料：1—1.5ml过夜培养的E.coli菌液、1.5ml离心管、离心管架、手套、
Spin column、中枪头、大枪头、平板纸
设备：20—200ul的移液器、100—1000ul的移液器、台式高速离心机、涡旋振荡器, 电泳仪,琼脂糖平板电泳装置、恒温水浴锅等
试剂：RNA酶溶液、Resuspension Buffer、细胞Lysis Buffer、Neutralization Buffer、Wash Buffer、无水乙醇、Elution Buffer、取离子水或TE溶液
五、            实验步骤
（一）质粒提取
(培养大肠杆菌)→收集菌体→重悬菌体→裂解细胞→沉淀除杂→离心初步纯化→膜过滤纯化→洗脱收集质粒DNA
1，将1ml过夜培养的细菌菌液加入1.5ml离心管中
2，4℃下10000rpm离心30秒，弃上清液，将管倒置于平板纸上数分钟,使液体流尽（可重复多次，但不能过量）
3，加250ul Resuspension Buffer,剧烈振荡，使菌体沉淀重新悬浮至没有细菌团块，加RNA酶溶液，2—8℃放置5—10分钟
4，加250ul细胞Lysis Buffer，轻柔颠倒4—6次，冰浴5分钟（不要剧烈振动，以防止基因组DNA被剪切。反应不超过5分钟）
5，加350ul预冷的Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管4—6次，冰浴中5-10分钟（溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀）
6，4℃下13000rpm离心5-10分钟（直至形成紧密的白色沉淀）
7，将上清液转移到Spin column内，4℃下6000rpm离心1分钟，并弃去接液管内液体
8，按Wash Buffer瓶身标签标明体积加入无水乙醇，并将其混匀
9，向Spin column内加650ul Wash Buffer，4℃下12000rpm离心30-60秒，并弃去接液管内体
10，重复第9步
11，4℃下12000rpm离心1分钟，然后将Spin column转移到无菌的1.5ml离心管中（如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除）
12，向Spin column内加50ul Elution Buffer、去离子水或TE溶液，并于室温静置1分钟（洗脱液体积可根据实验的实际需要决定）
13，4℃下12000rpm离心1分钟1.5ml离心管内溶液中含有质粒DNA
（二）质粒检测
1，琼脂糖电泳检测（0.8—1﹪ Agarose gel）：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型
2，吸光值检测:采用分光光度计检测260nm、280nm、320nm波长吸光值，
浓度（ug/ml）=50×OD 260nm×稀释后的体积
目标 2.0≧OD 260-320nm/ OD 280-320nm≧1.8
1.0≧OD 260nm≧0.1,the result of ratio is much reliable
若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染
六、            注意事项
1，实验前检查细胞Lysis Buffer、Neutralization Buffer是否有沉淀，如果有沉淀用37℃温浴溶解
2，不要剧烈摇晃Lysis Buffer
3，提取过程应尽量保持低温
七、            常见问题及对策
1，没有提取到质粒
如在洗脱后，发现溶液中没有质粒DNA，请检查是否按Wash Buffer瓶身标签标明的体积加入了无水乙醇
2，质粒提取率低
①    请先确认培养的细菌，配出培养过程中的杂菌污染、质粒丢失等原因
②    加入重悬也后应使菌体沉淀充分悬浮分散
③    在洗脱前将Elution Buffer于30—60℃温育，可提高提取效率
3，吸光度测量结果问题
①    吸光度测量的是未知样品与调零标准之间的相对吸光度，所以请用与洗脱液体相同的液体，对测量样品进行稀释和调零
②    OD 260nm/280nm的比值偏低，可用Wash Buffer多一次对离心柱进行洗涤
③    如OD 260-320nm/ OD 280-320nm的比值偏低，说明有蛋白质污染。应在加入Neutralization Buffer后，以足够高的转速离心，使沉淀紧密，并小心地吸取上清液，避免吸入沉淀
④    如OD 260-320nm/ OD 280-320nm的比值偏高，说明有RNA污染，请在重悬液中加入RNase A至终浓度100ug/ml
4，电泳结果问题
①    有基因组条带。在加入Lysis Buffer、Neutralization Buffer后，颠倒离心管应柔和，以避免基因组DNA收到剪切
②    有RNA污染。请在重悬液中加入RNase A至终浓度100ug/ml