β--内酰胺酶

β-内酰胺酶及其检测方法
β-内酰胺酶是细菌产生的可水解β-内酰胺环抗生素的酶。β-内酰胺酶（β-lactamase）的产生是细菌对(β内酰胺类)抗菌药物耐药最常见的机制，，广泛地涉及到许多社区获得性感染和医院内感染的重要病原菌，在各种耐药机制中占80%。β-内酰胺酶是由多种酶组成的酶家族，通过水解或非水解方式破坏进入菌体内的β-内酰胺环，导致β-内酰胺类抗生素失活，这些酶的基因存在于细菌的染色体或质粒中。它的种类和数量现已超过了400种，β-内酰胺酶分类比较多而复杂，最常用的有两种，即分子生物学方法和布氏法。
其检测方法包括常规方法和分子生物学方法。前者包括微生物法，碘量法，纸片酸度定量法，.产色头胞菌素法；后者包括转移性分析，基因分析，
酶蛋白性质分析。
一  β内酰胺酶的合成、定位及传播方式
β内酰胺酶既可以在细菌内组成型表达，如铜绿假单胞菌；又可以由质粒介导的诱导表达，如嗜水气单胞菌及金黄色葡萄球菌。而质粒介导的方式是细菌耐药性传播的一个主要机制，在革兰氏阴性菌中利用接合的方式进行传播，而在革兰氏阳性菌中利用转导的方式获得耐药性状。细菌的这种耐药性状的可转移性正是细菌耐药性爆发的原因。在革兰氏阴性菌中，β内酰胺酶象胞外酶一样被分泌到膜外的环境，而在革兰氏阳性菌中，β内酰胺酶在它与受体结合以攻击抗生素的之前则停留在周质腔中。
二  β内酰胺酶的作用机制
β内酰胺酶破坏β内酰胺抗生素的β内酰胺环有两种作用机制。
第一，绝大多数常见的β内酰胺酶有一个依赖丝氨酸发挥作用的机制，并且根据氨基酸序列组成分为三类（A，C和D）。通常它们的活性位点具有一个狭窄的纵形沟状结构，在沟的底部形成了一个空腔（氧阴离子袋），这种疏松的构造容易弯曲，便于结合底物。由于β内酰胺环上的羰基碳在结合β内酰胺酶活性部位的丝氨酸时发生了不可逆的反应，结果使其成为开环物，进而重建了β内酰胺酶。这类酶对青霉素、头孢菌素、单内酰环类抗生素都有活性。
第二，是一类不大多见的β内酰胺酶，被称为金属类β内酰胺酶，或B类β内酰胺酶。它们的特点是利用一个2价金属离子，绝大多数为锌离子，分别与组氨酸或半胱氨酸结合，或同时与二者结合，并与β内酰胺类抗生素的羰基碳的酰胺键相互作用，使其不能发挥作用。这类酶主要对青霉素、头孢菌素、碳青酶烯类抗生素发挥作用，但对单内酰环类抗生素无效。
三  β内酰胺酶的分类
迄今为止，人们发现的β内酰胺酶的性质多种多样，从20世纪60年代后期以来人们做了许多尝试将其分类。这些分类方法主要有两个原则：第一种也是最古老的方法是基于酶的生化及功能特性；第二种方法是基于酶的分子结构。
1.  β内酰胺酶的功能学分类
现有几种标准来用于β内酰胺酶的分类，包括抗生素的抑菌的作用范围，β内酰胺酶的耐药范围，β内酰胺酶的等电点、最大水解速度、结合常数、等电聚焦、蛋白分子量等方法。
最新的分类方法是Bush于1995年提出，他将β内酰胺酶分为四个大类（1－4）及六个亚类（a－f）。
第1类为耐头孢菌素的β内酰胺酶，但不被克拉维酸所抑制，分子生物学分类属于C类。
第2类为耐青霉素酶、耐头孢菌素酶，可以被克拉维酸所抑制，分子生物学分类属于A和D类，是由最初的TEM和SHV基因表达的结果。但由于表达的β内酰胺酶的TEM和SHV基因数量越来越多，它们首先被分为两个亚类2a和2b。2a亚类只包括耐青霉素酶，而2b亚类范围较广，它可以使青霉素、头孢菌素以同样速度失活。进一步的分类都是在2b基础上划分的：亚类2be，字母e代表广谱酶活性，即ESBLs，可以使第三代头孢菌素（头孢他啶、头孢噻肟、头孢泊肟）失活，还可以使单内酰环类抗生素（氨曲南）失活；亚类2br，字母r表示减少与克拉维酸及舒巴坦的结合，所以也被称为TEM基因表达的有抗性的抑制剂，可是它们依然对他佐巴坦敏感。随后又分出4个亚类，亚类2c是对羧苄青霉素效果比对青霉素要好，而且对氯唑西林有一定的作用。亚类2d的酶对氯唑西林耐药效果比对青霉素要好，对羧苄青霉素有一定的作用；这些酶很少被克拉维酸所抑制，并且这些酶中的一部分成为ESBLs。亚类2e的这些酶是耐头孢菌素酶，但同样可以水解单内酰环类抗生素，也可以被克拉维酸所抑制。亚类2f被加上是因为它们是依赖丝氨酸发挥作用的耐碳青酶烯酶，与第3类中的依赖锌离子发挥作用的耐碳青酶烯酶形成对比。
第3类是依赖锌离子或金属离子的β内酰胺酶，分子生物学分类属于B类。它们是唯一的在锌离子或金属离子辅助下发挥作用的酶。它们可以水解青霉素、头孢菌素、碳青酶烯抗生素。这样，碳青酶烯抗生素既可以被亚类2f酶(丝氨酸作用机制)抑制，又可以第3类酶（锌离子作用机制）所抑制。
第4类酶是不能被克拉维酸所抑制的耐青霉素酶，但目前在分子生物学上没有分类。
2  β内酰胺酶的分子生物学分类
β内酰胺酶的分子生物学分类方法是基于核酸及氨基酸的序列的差异。迄今为止，人们已经确认了四种类型的β内酰胺酶（A、B、C、D），相对应的功能学上分类如前所述。其中A类、C类和D类β内酰胺酶是依赖丝氨酸发挥作用，而B类β内酰胺酶是依赖锌离子或金属离子辅助下发挥作用的酶。
A类酶包括多种质粒编码的青霉素酶，活性部位为丝氨酸残基，分子量为29kDa；
B类酶为金属酶，由染色体或质粒编码，酶活性需锌离子参与，可被乙二胺四乙酸（EDTA）抑制；
C类酶的活性部位为丝氨酸残基，分子量为39 kDa，其产生与诱导剂有关；
D类酶又称为OXA型（水解苯唑西林）β-内酰胺酶。
四  β内酰胺酶的检测方法
1.常规方法
(1).微生物法：
[原理] 以一种对青霉素高度敏感的细菌-枯草芽孢杆菌作为指示剂，试验时如果被测细菌株产生青霉素酶，破坏了青霉素，则此高度敏感菌株即可生长，否则，指示剂则被抑制。
[方法] 以枯草芽孢杆菌为指示菌，用棉拭子将枯草芽孢杆菌接种于琼脂培养基上，或倾注方法将枯草芽孢杆菌混于琼脂平板内。然后将被测菌与产青霉素酶阳性及阴性对照菌株，按下图接种划线，在琼脂培养基中央放置一含青霉素G（1单位）纸片。放置35℃培养24小时后观察结果。
[结果判断] 如被检菌产生青霉素酶，则沿着被测菌处的枯草芽孢杆菌抑菌环出现凹痕。
[应用] 生物学方法是古老的方法，由于特异性差、灵敏度低，现在基本上很少被采用。
(2).碘量法
[原理] β-内酰胺酶能裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的兰色复合物，使兰色变为无色。
[方法]
①将0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸盐缓冲液中，使其浓度成6000ug/ml。取0.1ml于一小试管中。
②将培养18-24小时的细菌在含青霉素试管内制成浓厚菌悬液（109/ ml）。
③在37℃水浴中放置30分钟，不时摇动，使酶能破坏青霉素。
④加入1%可溶性淀粉溶液0.5 ml，摇匀。
⑤加入碘液0.02 ml。
⑥在37℃水浴中放置10分钟，观察结果。
[结果] 在10分钟内能使兰色完全消退的菌株为β-内酰胺酶阳性，不消退者为阴性。
[注意事项]
①由于青霉素很容易分解，因而用于实验的青霉素应新鲜配制。
②淀粉也新鲜配制，在100 ml蒸馏水中加入1克可溶性淀粉，放到开水中水浴直到淀粉溶解。
③实验应按照步骤操作，如果碘加得过早，酶反应就会停止，产生假阴性结果。
④每次试验最好用阳性和阴性对照。
[应用] 常用于检测淋病奈瑟氏菌。
（3）.纸片酸度定量法
[原理] β-内酰胺酶能破坏青霉素中的β-内酰胺环，形成青霉噻唑酸，使PH降低，指示剂溴甲酚紫颜色由紫变黄。
[方法]
①将一小片Whatman滤纸放于空平皿中。
②让滤纸吸足青霉素溶液（0.05M磷酸缓冲液，PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%无缓冲剂的结晶青霉素）。
③用接种环把10-20个菌落涂到滤纸上，
④盖好平皿后，将滤纸片在37℃孵育30分钟，观察结果。
[结果] 产β-内酰胺酶的菌株使滤纸颜色由紫色变黄色，一般在10分钟内即能看到。
[应用] 纸片酸度定量法一般用于检测淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌和葡萄球菌。
（4）.产色头胞菌素法
[原理] 产色头胞菌素如头胞硝噻吩（nitrocefin）的β-内酰胺环能被β-内酰胺酶所破坏，使其颜色由浅黄色变为粉红色，以此来测定细菌的产酶情况。
[方法] 将头胞硝噻吩（nitrocefin）纸片置于干净的平皿内，用无菌的牙签或接种环挑取细菌菌落涂于纸片上，观察纸片有无颜色变化。
[结果] 纸片涂抹处如颜色由浅黄色变成粉红色，表示该菌产生β-内酰胺酶，如颜色不变，表示细菌不产生β-内酰胺酶。
[应用] 头胞硝噻吩（nitrocefin）主要检测淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉氏菌（布拉汉氏菌）、葡萄球菌，结果可靠。莫拉氏菌（布拉汉氏菌）只能用头胞硝噻吩（nitrocefin）法。
（对于淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉氏菌（布拉汉氏菌）快速测定β-内酰胺酶比做药敏试验能更快地得到临床需要的结果。β-内酰胺酶试验还可验证葡萄球菌对纸片法青霉素的敏感试验结果是否可信。肠杆菌科、假单胞菌科及其它需氧革兰氏阴性杆菌不必测定β-内酰胺酶，因其结果常常不能预测这类细菌对临床常用来治疗β-内酰胺类抗生素药物的敏感性。）
2.分子生物学方法
1．酶蛋白性质分析：包括表型分析和酶动力学分析。
耐药表型分析：纸片药敏试验和E-试验测定MICs
提取酶粗提物进行a.三相水解试验。
b.等电聚焦电泳。
c.酶动力学分析。
2．基因分析：基因型别分类、测序、分析其结构基因和调控基因。
a.PCR扩增及PCR产物测序。
b.PCR扩增整合子全可变区，分析其中结构和可能的β-内酰胺酶基因。
c.鸟枪法克隆可表达的β-内酰胺酶基因，分析基因结构。
3．转移性分析：分析酶编码基因位于质粒上还是染色体上，在不在整合子中。
A。质粒：
a.质粒接合试验。
b.转化试验：电转化、钙转化或MgCl2转化
B。整合子：PCR扩增整合子全可变区及PCR产物序列测定。
另外，基因芯片可用于病原微生物耐药基因的表达谱检测、突变分析、多态性的测定。病原体的耐药基因的检测可通过两种方式：表达谱芯片检测药物诱导的基因表达改变来分析其耐药性；寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点从而分析其耐药性。
注：资料来自互联网整理。