培养基

培养基medium
（一）培养基定义
培养基(medium)是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。任何培养基中均需含有微生物所必需的能源、碳源、氮源、矿质元素、水和生长因素，但不同营养类型、不同种类的微生物对营养元素的要求又有很大差异。目前已使用的各种培养基都是前人经过反复实践，比较设计的成果。
（二)培养基的基本成分
能源、碳源：自养微生物以二氧化碳为碳源，光或无机物为能源，在无机物组成的培养基中生长。例如化能自养型的氧化硫杆菌培养基中，加入粉末状
硫为能源，以空气中的CO2为碳源。异养微生物以有机物为碳源和能源，培养基中常需加入葡萄糖、蔗糖或麦芽糖、乳糖等单糖或双糖，有的可利用淀粉、
纤维素等多糖，或利用动物组织中的糖类。例如培养细菌常用的牛肉膏蛋白胨培养基，其中牛肉膏即为主要碳源和能源。(培养基配方见后，下同)
氮源：自养微生物以含氮无机物铵盐、硝酸盐等为氮素营养，例如氧化硫杆菌以(NH4)2SO4为氮源；异养微生物以无机物铵盐、硝酸盐或含氮有机物为
氮源。自生固氮菌利用空气中的N2为氮素营养，其培养基中无须加入氮源，称为无氮培养基。
矿质元素、生长因子：微生物生长繁殖需要P、K、Na、S、Mg、Ca等主要矿质元素以及Fe、Cu等微量元素，因此培养基中常加入K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、KCl、FeSO4等无机盐类；生长因子主要是调节微生物代谢活动的B族维生素，常由酵母膏、肝浸出液等提供。许多天然成分的原料如牛肉膏、麦芽汁、玉米粉、豆芽汁等，含有各种无机元素和生长因子，不需另外添加。某些微生物的生长需要特殊的生长因子，如嗜血杆菌需要在培养基中加入Ⅴ(辅酶）、Ⅹ（高铁血红素）
（三）培养基的类型
根据原料来源不同，可将培养基分为合成培养基、半合成培养基与天然培养基。
合成培养基：由化学成分已知的有机物和无机物配制而成。成分精确，重复性强。但营养局限，微生物生长缓慢。适用于菌种分离、选育、遗传分析及生物测定等。如培养放线菌的高氏培养基、培养霉菌的察氏培养基以及各种化能自养菌培养基等。
半合成培养基：由某些天然物质与少量已知成分的化学物质配制而成。营养全面，能有效地满足微生物对营养的需求。广泛应用于微生物的培养。如培养细菌用的牛肉膏蛋白胨培养基，培养霉菌的土豆葡萄糖培养基，工业生产中常用的玉米粉等天然物质加无机盐配制的各种发酵培养基等。
天然培养基：由化学成分不清楚或不衡定的天然有机物配制而成。成分复杂，但营养丰富全面。常用于实验研究和生产。如麦芽汁培养基、玉米粉培养基，以及生产中使用的麸皮、锯末等。
根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基。
液体培养基：用各种营养成分加水配成，或用天然物质的浸汁(麦芽汁、豆芽汁等)制成。组分均一，适宜各类微生物的营养生长。广泛应用于实验研究及大规模工业生产中，有利于广泛获得大量菌体或代谢产物。
固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂，或用麸皮等固体原料配制。常用的凝固剂是琼脂(又称琼胶、洋菜)，由石花菜等海藻中提取加工制成。市售琼脂为条状、片状或粉末状，主要成分为多聚半乳糖的硫酸酯，绝大多数微生物不能将其分解，在培养基中仅起支撑作用。其熔点约98℃，凝固点42℃，1.5～2％(2%--2.5%书上记录)的水溶液在一般培养温度下呈凝胶状态。琼脂固体培养基广泛应用于微生物的分离培养、菌种鉴定和保藏。
半固体培养基：液体培养基中加入0.2～0.5％琼脂制成。用于观察细菌的运动、菌种鉴定及测定噬菌体的效价等。
根据培养基的用途，可分为选择培养基、鉴别培养基、加富培养基、基本培养基等。
选择培养基：根据某一类或某种微生物的特殊营养要求而设计的培养基，用于提高所需微生物的分离效率。如分离固氮微生物的无氮培养基、加入滤纸条或纤维素粉为碳源分离纤维分解菌的培养基。在培养基中加入某种化合物，可有效地分离出对这种化合物有抗性的微生物，例如在放线菌培养基中加入数滴10％的酚，可抑制细菌和霉菌的生长；加入一定量的青霉素、链霉素，可抑制细菌生长等。
鉴别培养基：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂，通过显色反应以鉴别不同的微生物。例如检查乳制品和饮用水中是否有肠道细菌污染所用的伊红-美蓝培养基。当大肠杆菌等肠道细菌生长时，发酵培养基中的乳糖，使加入的伊红-美蓝变色，在菌落上沉积为紫黑色，并呈现金属光泽。
（四）培养基的制备方法
以下为常规方法，如配方中有特殊规定或要求，以配方为依据。
1.根据配方，计算各种营养成分用量。一般药品可用普通药物天平称量，用量少的药品，可按比例配成高浓度溶液，再按所需量用移液管吸取。称好的药品放入玻璃烧杯或搪瓷杯中。
2.在另一容器中将所需量的水(一般可用自来水，有特殊要求时需用蒸馏水)加热，取全量的1/3左右倒入放药品的容器中，用玻璃棒搅拌，待药品全溶后，再将其余热水全部倒入。
3.若配制固体培养基，则称取1.5～2％?(2%--2.5%)的琼脂放入已溶化的营养液中，继续加热至琼脂全部溶解。加热中随时搅拌，防止溢出或糊底。烧糊的培养基营养物质破坏，并产生有毒物质，不宜再用。
4.待溶化的培养基稍冷却后，按配方要求调整pH值。先取10毫升培养基装入试管中，用pH试纸测其自然pH，再用1％NaOH(或1％HCl)调至所需pH，根据用量计算，换用10％NaOH(或10％HCl)调整所配全量培养基的pH。加碱(或酸)溶液时，应边滴加边搅拌，至应加量将近用完时，再次测试，最后调至要求的pH值。
5.配好的培养基，根据需要趁热分装至试管或锥形瓶中。分装需用漏斗，以免琼脂粘在管口或瓶口上。装瓶量一般为瓶容量的1/3～1/2；装试管一般为试管高度的1/5～1/4，以免灭菌时培养基上溢，粘湿棉塞。
6.用预先制好的棉塞塞住管口或瓶口。棉塞既有利于通气，又有滤菌作用，故松紧、大小应适当，以免使用时影响操作。
最后用牛皮纸或报纸包住棉塞，扎紧在瓶颈或试管上方，以免灭菌时水蒸汽沾湿棉塞或脱落。
7.灭菌后取出的固体培养基，根据需要可将试管立即斜放，冷凝后即成斜面培养基，用于菌种扩大培养及保藏；锥形瓶中的培养基，倒入无菌培养皿中，冷凝后即制成平板培养基，可用于菌种的分离、鉴定等。液体培养基冷却后可直接根据需要接入菌种。
(五）培养基配方举例
1)   氧化硫杆菌培养基
粉状硫10克
MgSO40.5克
(NH4)2SO40.4克
FeSO40.01克
KH2PO44克
CaCl20.25克
水1000毫升
自然pH
2)   牛肉膏蛋白胨培养基(常用的细菌培养基)
牛肉膏5克
蛋白胨10克
NaCl5克
水1000毫升
pH7.2～7.4
琼脂15～20克
3)   高氏一号培养基(常用的放线菌培养基)
可溶性淀粉20克
KNO31克
K2HPO40.5克
MgSO40.5克
NaCl 0.5克
FeSO40.01克
水1000毫升
琼脂15～20克
pH7.4～7.6
4)   察氏培养基(培养霉菌用)
蔗糖 20克
NaNO33克
K2HPO41克
KCl1克
MgSO40.5克
FeSO40.01克
琼脂20克
水1000毫升
自然pH
5)   无氮培养基(培养自生固氮菌用)
葡萄糖 10克
NaCl0.2克
KH2PO40.2克
CaSO4·2H2O0.1克
MgSO40.2克
CaCO35克
琼脂 20克
水1000毫升
自然pH
6)   伊红-美蓝培养基(检查肠道细菌用)
蛋白胨 10克
K2HPO42克
乳糖10克
琼脂25克，
水1000毫升
pH7.6
2％伊红水溶液2毫升
0.5％美蓝水溶液2毫升
将乳糖、伊红、美蓝分别灭菌后，加入灭菌的培养基中摇匀，倒平板。
来源：来宝网
7）SS琼脂
基础培养基
牛肉膏　　5g
脙胨　5g
三号胆盐3.5g
琼脂　17g
蒸馏水1000mL
完全培养基
基础培养基100mL
乳糖10g
柠檬酸钠8.5g
硫代硫酸钠8.5g
10%柠檬酸铁溶液10mL
1%中性红溶液2.5mL
0.1%煌绿溶液0.33mL
加热溶化基础培养基，按比例加入上述染料以外之各成分，充分混合均匀，校正至pH7.0，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。
注：①制好的培养基宜当日使用，或保存于冰箱内于48h内使用。
②煌绿溶液配好后应在10d以内使用。
③可以购用SS琼脂的干燥培养基。
【用途与用法】
用于沙门氏菌、志贺氏菌的选择性分离培养
有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。因选择性过强，可影响检出率，所以，使用时最好加一种弱选择平板以配对互补。
8）麦康凯琼脂
成分
蛋白胨17g
脙胨 3g
猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g
氯化钠　 5g
琼脂　17g
蒸馏水1000mL
乳糖10g
0.01%结晶紫水溶液10mL
0.5%中性红水溶液5mL
制法
1　将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2。将琼脂加入600mL加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。
2　临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。
注：结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。
具中等强度选择性，抑菌力略强，有少数革兰阴性菌不生长。在麦康凯平板上能否生长，是非发酵菌鉴定的一个依据。？
9）克氏双糖铁琼脂(换用方法)
成分
蛋白胨　　　　　　 20g
牛肉膏　　　　　　 3g
酵母膏　　　　　　 3g
乳糖　　　　　　　 10g
葡萄糖　　　　　　 1g
氯化钠　　　　　　 5g
柠檬酸铁铵　　　　 0.5g
硫代硫酸钠　　　　 0.5g
琼脂　　　　　　　 12g
酚红　　　　　　　 0.025g
蒸馏水　　　　　　 1000mL
pH7.4
制法
将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到比较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用。
克氏双糖铁琼脂(KI)
上层培养基成分
血消化汤(PH7.6)　　　 500mL
琼脂　　　　　　　　　6.5g
硫代硫酸钠　　　　　　0.1g
硫酸亚铁铵　　　　　　0.1g
乳糖　　　　　　　　　5g
0.2%酚红溶液　　　　　5mL
下层培养基成分
血消化汤(pH7.6)　　　 500mL
琼脂　　　　　　　　　2g
葡萄糖　　　　　　　　1g
0.2%酚红溶液　　　　　5mL
制法
1　取血消化汤按上层和下层的琼脂用量，分别加入琼脂，加热溶解。
2　分别加入其他各种成分。将上层培养基分装于烧瓶内；将下层培养基分装于灭菌12mm×100mm试管内，每管约2mL。115℃高压灭菌10min。
3　将上层培养基放在56℃水浴箱内保温；将下层培养基直立放在室温内，使其凝固。
4　俟下层培养基凝固后，以无菌手续将上层培养基分装于下层培养基的上面，每管约1.5mL，放成斜面。
10）伊红美蓝琼脂 (EMB)
伊红美蓝琼脂是由 HOLT-HARRIS and TEAGUE (1916) 提出，按照 GB 标准和 SN 标准规定的培养基，用于食品、乳制品、水源和病源标本中的革兰氏阴性肠道菌的分离和鉴别。蛋白胨提供细菌生长发育所需的氮源、维生素和氨基酸，乳糖提供发酵所需的碳源，磷酸氢二钾维持缓冲体系，伊红γ和美蓝抑制绝大部分革兰氏阳性菌的生长。琼脂是凝固剂。大肠杆菌在 EMB 上发酵乳糖，形成黑色菌落，大部分有金属光泽。沙门氏菌形成无色菌落。金黄色葡萄球菌基本上不生长。
成方 (g/L)
蛋白胨10.0
乳糖10.0
伊红γ0.4
美蓝0.065
磷酸氢二钾 (K2HPO4）2.0
琼脂15.0
pH 7.1 ± 0.2 25 ℃
此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。
注意  此培养基仅用于试验室使用。
用法
称取本品 37.4g 加热溶解于 1000ml 蒸馏水，分装三角瓶 , 每瓶 200ml ， 121 ℃ 高压灭菌 15min ，冷至 50 ℃ 时倾倒无菌平皿。
贮存
制备好的培养基保存于 2 -8 ℃ ，应避免光线直接照射。干燥培养基应放置于阴暗干燥处， 保存温度为 2 -25 ℃ 。
失效
干燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用。
操作步骤
使用前，把制备好的培养基放置室温 10-15 分钟。
1.     按不同的标准和方法制备样品；
2.     把样品液加入试管中；
3.     37oC 培养 18-24 小时进行计数。 .
质量控制
1 、外观： 此干燥培养基的粉末均匀，具有良好的流动性，呈紫红色。配制好的平板呈暗红到蓝紫色。
2 、微生物试验
在 37oC 培养 18-24 小时：
质控菌株
菌号
生长情况
菌落颜色
金属光泽
大肠杆菌
25922
好 - 很好
黑色
+
大肠杆菌 JM109
好 - 很好
黑色
+
大肠杆菌 DH5 α
好 - 很好
黑色
+
金黄色葡萄球菌
25923
不长 - 差
无色
-
沙门氏菌
好 - 很好
无
-
粪大肠菌群
好 - 很好
红色
-
志贺氏菌
好 - 很好
无色
-
方法的局限性
本培养基仅为细菌鉴定的一部份，需做其它补充试验。
可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进革兰阴性细菌生长，是较好的弱选择性培养基。发酵型革兰阴性杆菌因分解乳糖能力不同，在此平板上菌落颜色不同，便于鉴别菌种。
11）XLD 培养基
Xylose Lysine Desoxycholate Medium
一种选择性培养基，用来从食物和临床标本中分离和区分沙门氏菌和志贺氏菌的优秀培养基。
配方：
产品名称         产品成分        成分组成( 克/升 )
XLD 培养基
酵母浸膏       3
木糖         3.75
乳糖         7.5
蔗糖         7.5
Ｌ－赖氨酸      5
去氧胆酸钠     2.5
柠檬酸铁铵     0.8
硫代硫酸钠     6.8
NaCl           5
酚红         0.08
琼脂          12
PH 7.4 ±0.2
注意事项：
1、干燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用。
2、不能高压灭菌
察氏培养基

成分
硝酸钠　3g
磷酸氢二钾　1g
硫酸镁(MgSO4·7H2O)　0.5g
氯化钾　0.5g
硫酸亚铁　0.01g
蔗糖　30g
琼脂　20g
蒸馏水　1000mL
制法
加热溶解，分装后121℃灭菌20min。
用途
青霉、曲霉鉴定及保存菌种用。
12）大肠杆菌显色培养基
大肠杆菌显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养基，用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌的快速检测。大肠杆菌显蓝绿色，大肠菌群显无色，其它菌显黄色或无色，革兰氏阳性菌被抑制。
成份 (g/L)
特殊营养物质
37.9
显色剂
0.2
琼脂
12.0
pH 6.8 ± 0.2 25 ℃
此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。
注意
此培养基仅供实验室使用。
用法
称取本品 50.1g 加入 1000ml 蒸馏水，加热溶解并不停搅拌，煮沸不要超过 1 分钟。分装三角瓶， 121 ℃ 高压灭菌 15 分钟。取 1ml 制备好的样品液加入直径为 9cm 无菌平皿中心，倾入冷却至 45 -50 ℃ 培养基约15ml ，混匀，凝固后， 36 ± 1 ℃ 倒置培养 18 ～ 24h 。或冷却至 45-50 ℃时，倾入无菌平皿，琼脂完全凝固后，在 37 ℃的培养箱中倒置放置 1-2 小时，加入适当稀释度的样品液 1ml ，涂布于培养基上， 36 ± 1 ℃培养 18 ～ 24h 。
贮存
制备好的平板应立即使用，应避免光线直接照射。干燥培养基应放置于阴暗干燥处， 保存温度 2-8 ℃，注意避光保存。
失效
干燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用。
操作步骤
1 、按国家标准、 SN 标准、 FDA 标准或其它方法制备样品液
2 、取样品液 1ml 加入 冷却至 45-50 ℃显色培养基中混匀或 涂布于平板上
3 、 36 ± 1 ℃ 培养 18 ～ 24h ，选用有 30 ～ 200 个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠杆菌菌落。大肠杆菌典型菌落为蓝绿色，其它细菌为无色或黄色菌落。
总大肠杆菌 = 蓝绿色菌落
4 、对可疑大肠杆菌菌落可划线接种到营养琼脂平板上， 36 ± 1 ℃培养 12-16 小时，挑取单菌落做大肠杆菌全套生化试验 ( 本公司有生化鉴定管套装 20 支 x3 种 )
质量控制
1 、外观
此干燥培养基的粉末均匀，具有良好的流动性，呈乳白色。制备好的平板呈透明无色固体培养基。
2 、微生物试验
在 36 ± 1 ℃ 培养 18 ～ 24h 小时:
质控菌株
ATCC
生长情况
菌落颜色
单增李氏菌
27853
-/+
无色
金黄色葡萄球菌
25923
-/+
无色
大肠杆菌
25922
+++
蓝色
沙门氏菌
+++
无色
大肠菌群
+++
无色
方法的局限性
该显色培养基鉴定大肠杆菌 ，少数情况下可能会出现假阳性，但不会出现假阴性，有时可能需做其它补充试验。
典型特征
大肠杆菌典型菌落为蓝绿色，大肠菌群为无色菌落，其它细菌为无色或黄色菌落。
13）BAM Media M178: Wagatsuma Agar
January 2001
Bacteriological Analytical Manual
M178
Wagatsuma Agar
Yeast extract
3 g
Peptone
10 g
NaCl
70 g
K2HPO4
5 g
Mannitol
10 g
Crystal violet
0.001 g
Agar
15 g
Distilled water
1 liter
Human or rabbit
red blood cells,
fresh (24 h), with anticoagulant
50 ml
Mix fresh (within 24 h of drawing) human or rabbit blood with same or larger volume of physiological saline. Centrifuge cells at about 4000 x g at 4°C for 15 min. Pour off saline and wash 2 more times. After 3rd wash, pour off saline and resuspend cells to original volume with saline.
Suspend ingredients, except blood, in distilled water and boil to dissolve agar. Adjust to pH 8.0 ± 0.2. Steam 30 min. DO NOT AUTOCLAVE. Cool to 45-50°C. Add 50 ml of washed red blood cells to the cooled medium. Mix and pour into sterile petri dishes. Dry plates thoroughly and use promptly. Medium can be made in smaller volumes (requiring less blood) when few plates are needed.