异氟烷对大鼠缺血再灌注损伤肝脏ICAM-1表达及中性粒细胞浸润的影响

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第三军医大学
硕士学位论文
异氟烷对大鼠缺血再灌注损伤肝脏ICAM-1表达及中性粒细胞浸
润的影响
姓名：徐广民
申请学位级别：硕士
专业：麻醉学
指导教师：陶国才
20080501
第三军医大学硕士学位论文
异氟烷对大鼠缺血再灌注损伤肝脏ICAM．1
表达及中性粒细胞浸润的影响
摘要
目的：本研究旨在通过建立大鼠部分肝脏缺血再灌注模型，观察异氟烷麻醉大鼠
对常温肝脏缺血再灌注损伤的影响，探讨异氟烷抗炎作用参与减轻肝脏缺血再灌注损
伤的可能机制。
材料与方法：雌性SD大鼠32只，分为4组，每组8只：(1)PB．Sh锄组，大鼠
行腹腔注射1％戊巴比妥钠(PB)40mg．kg。1麻醉，进行手术但不阻断入肝血流。
(2)PB—IR组，采用戊巴比妥钠麻醉后行部分肝脏缺血再灌注(IR)。(3)Iso．Sh锄组，大
鼠仅接受1．O MAC异氟烷(Iso)吸入麻醉，不阻断血流。(4)Iso一取组，建立缺血再灌注
模型期间采用1．0 MAC异氟烷麻醉大鼠。大鼠常温部分肝脏缺血再灌注损伤模型的建
立，通过夹闭肝动脉和门静脉左支(支配肝左叶和中叶)，造成约70％肝脏缺血60min、
再灌注3h。实验终点，采取肝组织和血液标本。血清ALT和AST作为肝损害的标志
被检测；肝组织内髓过氧化物酶(MPO)活力测定；用IuPCR检测肝脏组织ICAM．1
和TNF．伐mI斟A转录水平；肝组织中IC删一1蛋白表达变化采用免疫组织化学染色和
免疫印迹(westem blot)方法检测；进行HE染色行病理学检查。
结果：
1．血清中ALT和AST水平的变化PB．IR组大鼠血清ALT，AST酶水平与其
他三组相比较明显升高(p相比有明显增加(p2．肝组织中ICAM．1和TNF．0c瑚RNA变化PB—IR组ICAM．1和TNF．cc的基因
表达较其他三组明显升高(P3．肝组织ICAM．1免疫组化结果PB．Sh锄组和Iso．Sh锄组血窦内皮细胞，肝
细胞、中央静脉和小叶间静脉微弱表达。PB．IR组内皮细胞、中央静脉和小叶间静脉
管壁强表达，肝细胞少量微弱表达。Iso—IR组可见内皮细胞和肝细胞轻度表达，较
PB．IR组弱(尸第三军医大学硕士学位论文
4．肝组织ICAM一1蛋白质水平测定杂交带密度值，以其表示ICAM．1蛋白的
表达水平。PB—IR组较其它三组明显增加(p组相比表达水平略增强，但是较PB．IR组明显减弱，且差异有统计学意义(P<0．05)。
5．MPO水平Iso．瓜组大鼠肝组织内MPO与PB．Sham组和Iso．Sham组相比有
明显增加(p<0．05)，但是较PB．瓜组显著降低(p<0．05)。PB-瓜组MPO水平较其他三组
相明显升高(p6．HE染色肝组织病理学改变PB。Sh锄组和Iso．Sh锄组的肝组织基本正常。
PB．IR组多见局灶性肝细胞坏死，亦可见肝细胞凝固性坏死；小叶周边区及中央静脉
周围可见明显的肝细胞脂肪变性，肝索结构被破坏。Iso．瓜组中央静脉和肝脏血窦稍
扩张，淤血。少量肝细胞变性，可见点状坏死，肝细胞脂肪变性，汇管区可见少量炎
症细胞浸润，肝索结构基本正常存在。
结论：
1．常温下对大鼠行70％的肝脏血流阻断60min、再灌注3h期间采用异氟烷(1．O
MAC)麻醉较使用戊巴比妥钠麻醉明显减轻血清ALT和AST。
2．戊巴比妥钠麻醉大鼠肝脏缺血再灌注后ICAM一1的基因转录和蛋白表达明显
增加。
3．异氟烷较戊巴比妥钠明显抑制大鼠肝脏缺血再灌注后ICAM．1的基因转录和
蛋白表达。
4．戊巴比妥钠麻醉大鼠肝脏缺血再灌注后TNF．0【的基因转录明显增加，异氟烷抑
制TNF．Q的基因转录。
5．戊巴比妥钠麻醉大鼠肝脏缺血再灌注后肝组织髓过氧化物酶(MPO)活力增加，
异氟烷较戊巴比妥钠抑制大鼠肝脏缺血再灌注后MPO的活力。
关键词：异氟烷；缺血再灌注损伤；肝脏；细胞间黏附分子．1；肿瘤坏死因子．a；
髓过氧化物酶
6
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Ef|’ects of isonurane on ICAM一1 expression and
neutrophil innltration in rats with liVer ischemia
■ n ● ● ●
ann reDerIUSlon lnl UrV
Abstract
objectiVe：
This study aimed to establish the rat model of wann panial hepatic ischemiareperfusion，
and investigate the protective and anti-inn锄matory ef．fects of isonurane on
wam hepatic ischemia—r印erfusion injury(瓜I)in rats．
Materials and Methods：
Thirty—two female Sprague-Dawley rats were diVided equally into 4黟oups(n=8)：
PB—Sham group in which the rats were anesthetized by intraperitonealⅫection of
pentobarbital sodium(1．O％，40mg．kg～，PB)and receiVed a sh锄operation without
occlusion of liVer blood now； PB-IR group whose rats underwent p叭ial hepatic
ischemia—reperfusion(IR)aRer anesthesia；Iso—Sh锄group in which inhalation of 1．O MAC
isonurane and sh锄叩eration was perf．omed；Iso—IR group in which 1．O MAC isonurane
was inhaled for 4 h and IR was perfomed． rat model of wann panial hepatic
ischemia—r印erfusion was established by clamping the h印atic arteries and hilar vessels
distributing to the 1eR and median lobes to induce panial hepatic ischemia(70％)for 60 min
followed by reperfusion for 3 h．The rats were killed 3 h after decl锄ping，and specimens
of liver tissue a11d blood were obtained．The serum AIJ and AST were detected as liver
d锄age markers． Ⅵability of myeloperoxidase(MPO) in liver were measured． The
expressions of ICAM一1 and TNF—cc were detected by R■PCR；The protein leVel of ICAM-1
in the 1iVer was detected by immunohistochemistry and Westem blotting．The histological
observation was carred out with hematoxylin and eosin staining．
Results：
1．Changes of semm ALT and AST The semm 1evels of AST and AU’in PB—IR
2
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铲oup were significantly higher than those in other 3 groups(尸≮O．05)．Serum enzyme in
Iso-IR铲oup was increased compared with PB—Sham 铲oup or Iso—Sham group， but
decreased with PB—IR group(P2．LiVer mRNA changes of ICAM一1 and TNF-0【mRNA expressions of ICAM-1 and
TNF—cc in PB—IR铲oups were significantly hi曲er man those in other 3 groups(PIsoflurane attenuated the mRNA expressions of ICAM-1 and TNF—C【(P3．Immunohistochemical assay of 1iVer ICAM-1 H印atic sinusoidal endothelial cells
(SECs)，h印atocytes，central Veins，and interlobular Veins showed weak staining of ICAM一1
in PB—Sh锄铲oup and Iso-Sham group．In me PB一瓜铲oup，strong staining to ICAM一1 was
obsenred on SECs，central Veins and interlobular veins，and weak staining on hepatocytes．
But in Iso—IR铲oup the positiVe area and intensity were much lower(P<0．05)．
4．Results of Westem blotting The expression 1evel of ICAM—1 was analyzed with
integral optical density of the blots．In the PB—IR group，ICAM一1 expression was increased
in comp撕son to other 3 groups(Pgroup than in PB—Sham group and Iso—Sh锄孕oup(尸≮O．05)．
5．MPO 1eVel The MPO in Iso—IR gr01lp was sigIlmcantly hi曲er than PB—Sham
铲oup and Iso-Sham group(PMPO in PB—IR group were signmcantly hi曲est(P6．Mo印hological changes of 1iVer The hepatic tissue was nomal both in PB—Sh锄
铲oup and Iso—Sham group．In the PB—R group，there were obViously localized hepatoc如c
necrosis，eVen coagulation necrosis．Some obVious f．atty degeneration of h印atocyte were
seen around 10bular peripheral and central Veins．The stmcture of hepatic cords was
destroyed．In Iso-瓜group，there were congestion and stretch both in central Veins and
sinudoids．Hepatoc”ic degeneration，and eVen spotty necrosis and f．atty degeneration were
observed．The neutrophils gathering were seen around me portal region．The basic stlllcture
of hepatic cords was reserVed．
Conclusion：
1．Rats treated with 1．O MAC isonurane during wann panial(70％)h印atic ischemia
60 min and 3 h of reperfusion haVe si盟ificantly 10wer semm ALT a工1d AST compaured with
rats anesthetized with pentobarbital sodium subjected to hepatic ischemia_reperfusion
1nJury．
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2． Gene and protein expression of ICAM-1 in rat hepatic tissue are significantly
increased by hepatic ischemia_reperfusion injury aRer pentobarbital sodium anesthesia．
3．Isonurane can siglli矗cantly iIlllibit gene and protein expression of ICAM-1 in rat
hepatic ischemia—reperfusion i巧ury in compadson to rats with pentobarbital sodium
anesthesia subjected to hepatic ischemia_r印erfusionⅫury．
4．mRNA expression of TNF—a in rat 1iver is signiflcantly increased by h印atic
ischemia_reperfusion injury aRer pentobarbital sodium anesthesia． Isonufane can
sigllmcantly inhibit expression ofTNF一仅in rat hepatic ischemia-reperfusion injury．
5．Ⅵability of MPO in me 1iVer is si朗ificantly increased by hepatic ischemia
-reperfusionⅫury aRer pentobarbital sodium allesmesia；Isonurane can sigIlificantly
inhibit MPO alteration in rat liver ischemia_r印erfusion injury compared with rats
anesthetized with pentobarbital sodium su切ected to h印atic ischemia_reperfusion injury．
Key words ：Isonurane；Ischemia—r印erfusion蜘ur)r；liVer；Intercellulor adhesion
molecule一1；Tumor necrosis f．actor一Ⅱ； myeloperoxidase
4
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英文简称英文全称
BSA
cDNA
DEPC
dNTP
DTT
EB
EDTA
EP
h
HCL
mln
英文缩写词表
Bovine senJm albumin
Complementary DNA
Deox蜘bonucleic acid
Deoxynucleoside triphosphate
Dithiothreit01
Ethidium Bromide
Ethylene di锄inetetraacetic
Eppendorf(tube)
HOur
Hydrochloric acid
Minute
M-MLV Moloney murine leukemia Vims
Na2S
0ligodT
PCR
RNA
Rnase
PVDF
SDS
TAE
Taq
TEMED
％s
Sodium sulfide
Oligo Deox”hymidylic acid
P01ylnerase chain reaction
Ribonucleic acid
Ribonucleases
PolyVinylidene difluoride
Sodium dodecyl sulphate
Tris Acetic acid
中文全称
牛血清白蛋白
互补DNA
脱氧核糖核酸
脱氧核糖核苷三磷酸
二硫苏糖醇
溴化乙锭
乙二胺四乙酸
埃彭道夫(管)
小时
盐酸
分钟
逆转录病毒
硫化钠
寡脱氧胸苷酸
聚合酶链式反应
核糖核酸
核糖核酸酶
聚偏(二)氟乙烯
十二烷基磺酸钠
三(羟甲基)氨基甲烷醋酸
Taq DNA p01ymerase 耐热性DNA聚合酶
Te：tramethylethylenediamine
Tris(hydroxymethyl)锄inomethane
四甲基乙二胺
三(羟甲基)氨基甲烷
第三军医大学研究生学位论文独创性声明
秉承学校严谨的校风和科研作风，本人申明所呈交的论文是我本
人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了
文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或
撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证
书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已
在论文中作了明确的说明并表示谢意。
申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。
论文作者签名：勰吼丛星堕形
第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书
本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定，即：研
究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人
保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军
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磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分
内容(保密内容除外)，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。
论文作者签名：挝& 指导教师签名：蛔
日期：坦星二堕兰
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异氟烷对大鼠缺血再灌注损伤肝脏ICAM．1
表达及中性粒细胞浸润的影响
．^L—-▲一
刖吾
肝脏缺血再灌注损伤是一项重要的临床问题，多见于常温下阻断肝门行部分肝切
除术、肝移植术、肝外伤以及休克等，术后发生肝功能衰竭、肝移植的排斥反应都与
之有关。肝脏缺血再灌注损伤的分子机制包括氧自由基产生增加、细胞内钙超载、细
胞因子的参与、Kupffer细胞(Kupffer cell，KC)激活以及中性粒细胞(Polymo叩honuclear
neutrophils，PMN)的聚集等多种因素综合作用【l，21。肝脏缺血时产生各种炎性介质包括：
补体因子(C5a)、细胞因子(TNF—u、IL一1)和CxC趋化因子等能刺激KC和PMN。再灌
注期细胞因子刺激中性粒细胞粘附分子(CDll／CDl8)的表达上调。同时各种细胞因子
激活肝血窦内皮细胞(Sinusoid endothelial cells，SEC)和肝细胞(hepatocytes，PC)使细胞
间黏附分子．1(Intercellulor adhesion molecule．1，IC√～M一1)等黏附分子表达上调。在各种
黏附分子(CDll／CDl8和ICAM一1)相互作用下，中性粒细胞聚集、粘附游走，并发生
呼吸爆发，产生大量氧自由基，释放蛋白水解酶和过氧化物酶等毒性物质，组织局部
发生过度炎症反应继发严重的肝脏细胞损伤。肝脏缺血再灌注时血窦内皮细胞及肝细
胞膜ICAM一1表达增加，ICAM一1介导中性粒细胞粘附、聚集，对内皮细胞和肝细胞
产生损伤【31。
吸入麻醉药对缺血再灌注损伤的保护作用已经在心肌、脑等重要脏器得到证实，
其作用具有一定的普遍性【4’5】。动物实验证实吸入性麻醉药可能通过抑制KC和PMN
产生氧自由基，减轻中性和肝细胞内钙超载、提高缺血再灌注期间肝细胞的能量贮备
等途径从而对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用，但具体的分子机制尚不清剁昏91。近来
研究发现吸入麻醉药能够抑制离体培养细胞以及循环中PMN表面粘附分子表达[10J 31。
动物实验发现麻醉药，尤其是异氟烷能够显著减轻由内毒素引起的全身炎症反应【14】。
据此，我们推测抑制黏附分子和中性粒细胞引起的局部过度炎症反应可能是异氟烷肝
脏缺血再灌注保护作用机制之一。为此设计并实施本项研究，为减少围术期肝脏缺血
再灌注损伤、寻找使用合理的麻醉药物提供理论依据。
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本实验通过建立大鼠部分肝脏缺血再灌注模型，观察缺血60min再灌注3h时血
清ALT和AST水平的变化以及肝组织病理学改变。进一步采用RT-PCR，免疫组织化
学染色和免疫印迹(westem blot)方法检测肝脏组织ICAM．1基因转录和蛋白表达变化，
然后检测肝组织TNF．a mRNA水平和髓过氧化物酶活力的变化。研究探讨异氟烷作用
下减轻肝脏缺血再灌注损伤的可能机制。
一、主要材料
(一)主要试剂
无水乙醇
异丙醇
冰醋酸
EDTA
氯仿
Tris碱
DEPC
TRIZOL
MMLV
Rnasin
01igodTl 8
dNTPs
5×MMLV Buf-fer
10×PCR Buffer
Taq酶
PCR引物
DNA Marker
溴化乙锭
琼脂糖
乙醚
硫化钠
材料与方法
(重庆川东化工集团有限公司)
(重庆川东化工集团有限公司)
(重庆川东化工集团有限公司)
(重庆川东化工集团有限公司)
(重庆川东化工集团有限公司)
(Si舯a公司进口分装)
(Sigma公司)
(罗氏公司)
(海博亚生物技术有限公司)
(上海博亚生物技术有限公司)
(上海博亚生物技术有限公司)
(上海博亚生物技术有限公司)
(上海博亚生物技术有限公司)
(上海博亚生物技术有限公司)
(上海博亚生物技术有限公司)
(重庆升博公司合成)
(北京天为时代生物有限公司)
(北京天为时代生物有限公司)
(上海东海制药厂)
(上海马陆制药厂)
(重庆化学试剂厂)
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组织细胞总蛋白提取液
蛋白酶抑制剂
山羊抗大鼠ICAM．1抗体
兔抗大鼠ICAM．1抗体
辣根酶(HRP)标记羊抗兔多聚体
兔抗羊IgG辣根过氧化物酶标抗体
异氟烷
戊巴比妥钠
髓过氧化物酶(MPO)测试盒
丙烯酰胺
N，N，．亚甲双丙烯酰胺
甘氨酸
SDS—PAGE次高分子量标准蛋白
考马斯亮蓝(G．250)
考马斯亮蓝(R．250)
十二烷基磺酸钠(SDS)
牛血清白蛋白(BSA)
溴酚兰
D．巯基乙醇
二硫代苏糖醇(DTT)
PVDF膜
DAB显示试剂盒
TEMED
中性树胶
苏木素
(二)主要仪器设备
Drager Fabius型麻醉机
S01ar8000 M型麻醉气体监测仪
Olmpus AU2700全自动生化分析仪
Kodak zF一4型凝胶成像紫外透射仪
DYY一6B型稳压稳流电泳仪
9
(Pierce公司)
(Merck公司)
(Santa Cmz公司)
(武汉博士德生物有限公司)
(北京中杉公司)
(北京中杉公司)
(上海雅培制药有限公司)
中国药物上海化学试剂公司
(南京建成生物有限公司)
(F1uka公司)
(F1uka公司)
(上海康达氨基酸厂)
(上海丽珠东风生物技术有限公司)
(Sigma公司)
(Sigma公司)
(Sigma公司)
(Roche公司)
(Sigma公司)
(Sigma公司)
(Gibco公司)
(Roche公司)
(中杉公司)
(Sigma公司)
(福州迈新生物技术公司)
(Sigma公司)
(德国Drager公司)
(美国GE公司)
(日本)
(上海顾村光电仪器厂)
(北京六一仪器厂)
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PTC一1 50 Minicycle PCR仪
BCD一272科隆冰箱
80—2离心机
百岭磁力混合器
XW一80A漩涡混合器
Eppendorf低温高速离心机
BIO—RAD凝胶成像分析仪
TMQ．R一3870自动台式灭菌器
格兰仕微波炉
300℃烤箱
Foma Scientific超低温冰箱
N35制冰机
碎冰机WF．A2000
SmanSpec3000核酸蛋白仪
B102000型生物液氮储存器
WSF．100．A振荡器
超低温冰箱
PowerAC 3000电泳仪
转印电泳仪
制冰机
恒温水浴箱
Du一640紫外分光光度计
凝胶成像系统Doc Gel 2000型
PH分析仪
JA2003A电子天
电子秤
(三)主要试剂的配制
1．5×TBE电泳缓冲液
Tris base
FnTA
10
(美国Sigma公司)
(科隆冰箱厂)
(上海手术器械厂)
(江苏江阴科研器械厂)
(上海医科大学仪器厂)
(德国)
(美国BG公司)
(上海新华医疗器械有限公司)
(广东顺德格兰仕微波炉厂)
(重庆银河实验仪器有限公司)
(美国Themo公司)
(德国Icematic公司)
(上海万欣设备公司)
(美国Biorad公司)
(国产)
(上海安亭科学仪器厂)
(日本SANYO公司)
(美国Biorad公司)
(美国Biorad公司)
(日本SANYO公司)
(上海精宏实验设备有限公司)
(美国Beckman公司)
(美国Biorad公司)
(美国Orion公司)
(上海精天电子仪器有限公司)
(北京赛名利斯仪器有限公司)
54 g
20 ml O．5m01／L(PH 8．O)
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硼酸27．5 g
ddH20 力口至1000ml
磁力搅拌充分溶解， 4℃保存，用时稀释。
2．溴化乙锭溶液
溴化乙锭0．29加ddH20至40ml，
3．75％乙醇
无水乙醇
DEPCddH20
振荡混匀，每日使用前新鲜配制。
4．30％丙烯酰胺贮存液
搅拌使其充分溶解。室温保存于棕色瓶中。
7．5ml
加至10m1
Acrylamide 299
BIS 19
加入约60ml超纯水，充分搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至100m1，用Whatman
滤纸滤去杂质；于棕色瓶中4℃冰箱保存。
5．1．5M Tris—HCl(PH8．8)：
称量181．79 Tris置于1L烧杯中：加入约800m1的超纯水，充分搅拌溶解；用浓
盐酸调节PH值至8．8；将溶液定容至1L，室温保存。
6．1．OM Tris-HCl(PH6．8)：
称量121．19 Ths置于1L烧杯中；加入约800m1的超纯水，充分搅拌溶解；用浓
盐酸调节PH值至6．8；将溶液定容至1L，室温保存。
7．10％SDS：
称量59高纯度的SDS，加入约40ml超纯水，68℃加热溶解，将溶液定容至50ml，
室温保存。
7．5×蛋白上样缓冲液：
1M Tris-HCl(PH6．8) 1．25ml
SDS O．59
溴酚蓝25mg
甘油2．5ml
加超纯水溶解后定容至5ml；小份(500¨l／份)分装后，于室温保存；使用前将25斗l
的p一巯基乙醇加到每小份中。
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8．4×蛋白电泳缓冲液：
Tris 69
甘氨酸28．89
SDS 29
加入约400ml的超纯水，搅拌溶解；超纯水定容至500ml后，室温保存。
9．10％过硫酸胺：
称取19过硫酸胺，加入10ml的超纯水后搅拌溶解，4℃冰箱保存。
10．1×电转移缓冲液(Transferbuffer)
嘶s 2．99
甘氨酸5．89
SDS O．379
加入约600m1的超纯水，充分搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至800m1，加入200ml
的甲醇，室温保存。
11．TBST缓冲液
NaCl
1M Tris—HCl(PH8．0)
加入约800m1的超纯水，充分搅拌溶解；
纯水将溶液定容至lL后，4℃保存。
12．考马斯亮蓝G．250溶液
考马斯亮蓝G．250
95％乙醇
85％磷酸
超纯水补足至500m1，用Whatman滤纸，
13．封闭液(3％脱脂奶粉溶液)
8．89
20ml
加入O．5m1 Tween 20后充分混匀；加超
50mg
25m1
50ml
4℃避光保存。
称量0．19 BSA加入到3m1的1×PBST缓冲液中，充分搅拌溶解，现配现用。
二．方法
(一)实验过程
1．实验动物：健康雌性SD大鼠(清洁级)32只，10～12周，体质量250～3009，
购自第三军医大学实验动物中心。1211／12h昼夜交替饲养，术前禁食12h，自由饮水。
2．大鼠部分肝脏动物缺血再灌注模型的建立(参见附图5、6)
所有实验大鼠根据分组分别接受戊巴比妥钠和异氟烷麻醉，麻醉后仰卧位固定于
12
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鼠板，硫化钠(8％)溶液胸腹部脱毛，消毒铺无菌巾。模型参考【15，161的方法：经腹正中
切口，分离肝脏周围韧带，暴露肝门，游离门静脉左右支，用小血管夹夹闭门静脉左
支(支配肝左叶和中叶)，建立大鼠70％肝脏缺血再灌注模型。实验过程中采用灯泡照
射保持大鼠直肠温度在36．5—37．5℃。术中间断经腹腔补液(生理盐水)。
3．实验分组
32只大鼠分为四组，每组8只，具体如下：
①PB．Sh锄组：仅分离肝脏周围韧带不阻断入肝血流。
②PB—IR组：行腹腔注射1％戊巴比妥钠(PB)40mg．kg‘1麻醉，进腹后行部分肝
脏缺血再灌注。
③Iso—Sh锄组：参照Lee川和靳艳卿【171等所描述的麻醉方法并改进：首先将麻
醉机回路和大鼠麻醉箱(一密闭玻璃箱，大小约为(30cm×20cm×20cm)进／出气口连接，
出气口连接大鼠面罩，然后以2～5L／min氧流量流经异氟烷蒸发罐，蒸发罐开启浓度
为2～3％，含麻醉药气体流经麻醉箱，出气口连接Solar8000 M型麻醉气体监测仪，
调整挥发罐，将大鼠置入待箱内异氟烷浓度达1．OMAC且稳定，持续吸入麻醉20min
后待大鼠肺内麻醉药浓度和箱内平衡后，迅速从箱内取出大鼠并将其口鼻部置于相同
浓度的大鼠面罩内继续维持麻醉，其余同PB．Sh锄组。
④Iso一瓜组：大鼠均接受1．O MAC异氟烷(Iso)吸入麻醉，行行部分肝脏缺血再灌注。
4．实验标本采集
缺血60min再灌注3h至实验终点。从下腔静脉采血3m1；门静脉置管，磷酸盐缓
冲溶液(1000U肝素)灌注10min后取中叶置于10％中性福尔马林液固定，同时取大鼠
左外侧叶部分肝脏组织装入冻存管中置于液氮冻存待检。血清标本室温静置1h后，4℃
离心(120009，15min)，抽取上清．20℃保存。
(二)指标检测
1．大鼠血清ALT和AST用01y111pusAU2700生化分析仪检测。
待标本集齐后送往西南医院检验科，采用Olympus AU2700生化分析仪检测。
2．免疫组织化学染色测定ICAM—l
(1)试剂配制
①O．01M枸橼酸盐缓冲液：枸橼酸三钠39，枸橼酸O．49加去离子水至1L，室温
保存备用。
②磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)
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NaCl 8 g
KCl O．29
Na2HP04 1．449
KH2P04 0．249
将上述各种试剂溶解于800m1去离子水中，用HCl或NaOH将PH调至7．4，加
水至1000m1即可，室温保存备用。
③DAB：临用时取1 ml去离子水，加DAB试剂盒(北京中杉)中A、B、C试剂
各1滴，混匀，1h内使用。
(2)免疫组化染色采用PowefVisionlM两步法，参考文献【18】后改良进行如下步骤操作：
①石蜡切片在60℃烤箱内烘烤30min，
②脱蜡至水洗：二甲苯I，lOmin；二甲苯II，10min。梯度酒精(100％、95％、
90％、85％、80％、75％各5mim，PBS冲洗3次／5min。
③灭活内源性酶：3％的过氧化氢处理20min后，PBS洗3次／5min；
④微波抗原修复：切片入枸橼酸钠缓冲液(O．01mmol／L pH6．0)，加热至95～100
℃20 min；冷却至室温后用PBS洗3次／5min；
⑤加入稀释度1：50兔抗大鼠ICAM．1抗体(武汉博士得)，湿盒孵育，4℃过夜；
PBS洗3次／5min；
⑥直接加入辣根酶(HRP)标记羊抗兔多聚体(北京中杉，PV-6001)，37℃30min；
PBS洗3次／5min；
⑦滴加新鲜配制DAB液于切片上，室温显色，显微镜下控制时间(3～5 min)，
充分蒸馏水冲洗中止反应；
⑧苏木精复染(30s)、蒸馏水水洗，盐酸酒精分化(3s)，蒸馏水冲洗返蓝，梯度酒
精脱水(70％、80％、85％、90％、95％、loo％各2min)、二甲苯透明，风干、中性树
脂封片。
⑨重复上述实验，以PBS代替一抗作阴性对照。
(3)结果判断
①ICAM．1的阳性染色结果为定位于肝内皮细胞以及肝细胞膜上的棕黄色颗粒。
②参照“等㈣的半定量评分方法：在光镜下(400×)，根据阳性细胞所占视野细
胞总数百分比和染色强度进行记分，分别记为：阳性细胞数<5％为阴性，5％～25％为
1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，75％以上为4分。阳性强度以淡黄色为
14
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1分，黄色为2分，棕黄色为3分。两者相乘，l～4分为弱阳性，5～8分为中等阳性，
9～12分为强阳性。
3．RT-PCR检测肝组织ICAM一1和TNF．Q mRNA
(一)肝组织总RNA的提取
(1)先把高温消毒处理过的研钵用液氮预冷，向钵内反复加入液氮，至少4～5次，
使研钵充分预冷。
(2)从液氮中取出标本，剪取适量组织约50mg。置入研钵中，加入1ml Triz01进
行研磨，同时加入少量液氮，确保研磨后无可见组织块，整个过程要及时添加液氮，
不可干燥。将匀浆液用移液器小心转移至1．5ml EP管中，冰浴10min。
(3)加入氯仿O．2ml，充分震荡混匀后静置5min。
(4)在预冷的离心机4℃下120009离心15min。
(5)小心吸取上清液0．5ml转移至新管，加入4℃预冷的异丙醇0．5m1混匀，．20℃
静置1h。
(6)4℃下120009离心15min，小心弃去上清。
(7)加入1m1用DEPC水新鲜配制的75％乙醇洗涤一次，小心倒掉乙醇，吸干。
(8)在超净工作台上风干沉淀，加入20“l DEPC处理过的双蒸水溶解沉淀，直接
行RT—PCR或．70℃保存。
(二)核酸蛋白仪测定RNA浓度
取1pl RNA样品稀释到100“l，转移至比色杯中，以DEPC处理过的双蒸水做空
白对照，读取各样品OD260、OD280以及OD260／OD280，RNA浓度=OD260×l肛g／ml。
(三)逆转录(RT)
(1)在DEPC处理过的无酶灭菌EP管中依次加入：
dNTPs 1¨l
MMLV 1肛l(200U)
5×MMLV Buffer 4“l
随机弓I物01igo dTl8 1“l
Rnasin O．5“l
RNA样品2嵋
无酶灭菌双蒸水补足20¨l，小心混匀，稍离心
(2)37℃孵育2h。
(3)95℃热变性5min，稍离心，得到cDNA
1 S
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(4)立刻行PCR，余者．20℃保存。
(四)聚合酶链式反应(PCR)
(1)引物序列TNF一0【和ICAM．1引物按照参照文献[1l】合成。
表1 大鼠ICAM．1、TNF一0L和GAPDH引物参数
引物大鼠基因序列产物长度退火温度(℃)
序列号
TNF一0【AF329986 5’一TACTGAACTTCGGGGTGATTGGTCC一3’ 295
5’一CAGCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC．3’
65
ICAM一1 NM012967 5’．TGTTTCCTGCCTCTGAAGC一3’ 409 60
5’．CTTCGTTTGTGATCCTCCG．3’
GAPDH AFl06860 5’．CAACGGCACAGTCAAGG一3’ 373 42．5
5’一CATGGACTGTGGTCATGAG一3’
GAPDH：glyceraldehyde一3一phosphate dehydrogenase； ICAM一1：intercellular adllesion molecule．1；
11NF一0【：tumor necrosis factor．
(2)操作
成分加入量
逆转录产物4．O“l
基因上游引物2．0 ul
基因下游引物2．0 LLl
10×Buffer 10．0“l
10mM dNTP 2．0 pl
Taq DNA聚合酶(1U／“1) 1．O“l
ddH20 补足体积至50¨l
混匀，离心15sec，使液体沉淀至管底；置于PCR仪中，按下列条件进行扩增：
预变性95℃，2 min l cVcle
变性94℃， 50 sec
退火ICAM．1 56℃， 50 sec
TNF一0【56℃， 50 sec 35 cycle
GAPDH 42．5℃，
延伸72℃，
最后延伸72℃，10 min
16
50 sec
90 sec
l cycle
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(五)琼脂糖凝胶电泳
(1)10×TAE 25m1，加双蒸水至250ml，配成1×TAE。烧瓶中加入1×TAE 100m1，
加琼脂糖19，微波炉小心加热至完全溶解。待冷却后加入10m∥ml的溴化乙锭5¨l，
充分混匀。胶板上放好齿梳，加入已配好的琼脂糖液。
(2)室温下平放，凝固后小心移去齿梳，将凝胶放入电泳槽，加入电泳液使其没
过凝胶约1mm。将PCR产物各5“1分别与6×加样缓冲液1“l混合后小心加入样品槽
中。通电，采用5V／cm电压降进行电泳。
(3)待溴酚兰条带泳动至凝胶2／3处时，切断电源，取出凝胶在紫外灯下观察并照相。
(六)凝胶扫描，密度分析
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，以紫外光进行密度扫描，并以共同扩增的GADPH
基因作为内参照，二者条带0D值×面积(Int×mm2)之比表示标本mRNA表达水平。
4．westem blot检测ICAM．1
(一)肝组织总蛋白提取
操作按照说明书进行。剪取液氮冻存的肺组织约1000mg，放入用高温灭菌的玻
璃匀浆器冰浴匀浆，加入1000肛l RIPA组织细胞裂解液和10¨l PMSF，冰上间或匀浆，
将匀浆液转移到2m1 EP管，冰上放置30min，4℃、200009离心30min，吸取上清液
至另一灭菌2ml EP管中，．70℃冻存或直接用于下一步实验。
(二)Bradford法测定蛋白含量
(1)在一组离心管中加入O．5m∥m1牛血清白蛋白(O、5、10、15、20、25、30“1)，
以0．15mm01／LNaCl补足至50“l，以50“l的O．15mmol／LNaCl作为空白对照。
(2)取另一组离心管，每管加入上述与之对应的混合液lOul，然后加入500ul考马
斯亮兰G一250染液，振荡混匀，室温放置5～10min。
(3)取100ul加入1cm光径的微量比色杯，在DU640紫外分光光度仪上595m波
长处测定各管光吸收值(0D值)，每个浓度制作三个副管，测得的数据存于计算机。
(4)计算机上白带程序以标准蛋白浓度为X轴，OD值为Y轴描绘蛋白浓度拟合
标准曲线(直线方程)。
(5)样本蛋白浓度测定：在作蛋白浓度标准曲线的同时，取待测蛋白提取液5“l
于标记试管中，加入75“1 NaCl(O．15mmol／L)混匀，取10ul和500u1考马斯亮兰G一250
漩涡振荡混匀，室温静置5min，取100u1放入比色皿中，用分光光度计于595啪处测
量吸光度OD值，每个样品作三个副管，根据标准曲线计算待测样本蛋白浓度。
(6)根据所得浓度，计算电泳上样体积。
17
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(三)SDS—PAGE电泳
①模具准备：采用小型垂直电泳装置，根据产品说明书安装玻璃板，形成凝胶腔，
准备灌胶。
②分离胶和浓缩胶溶液的制备：根据目的蛋白的分子量范围，配制10％的分离
胶和5％的浓缩胶。配方【20】如下：
lO％SDS—PAGE分离胶(15m1) 5％SDS．PAGE浓缩胶(5m1)
成分体积(m1) 成分体积(m1)
③分离胶凝胶液的注入和聚合：将所配制的分离胶溶液沿着凝胶腔的长玻璃板一
面缓缓注入直至5cm高度处为止，然后沿凝胶腔内壁缓慢加入异丙醇进行密封，以隔
绝空气中的氧和消除液面的气泡和弯月面，使凝胶表面平坦，1h后密封层与分离胶胶
层之间出现明显接口时，分离胶的聚合即完成。
④浓缩胶凝胶液的注入和聚合：倒除异丙醇，超纯水洗涤凝胶腔6次，滤纸吸干，
用同样的方式将所配制的浓缩胶溶液注入已聚合的分离胶上面，当凝胶液加至距凝胶
腔短玻璃板上沿约5mm时，立即插入样品梳，1h后浓缩胶聚合完成，除去样品梳，
超纯水洗涤梳孔6次，滤纸吸干，准备加样。
⑤蛋白样品的处理：用R姒裂解液调整待测蛋白样品的浓度为3mg／m1，吸取
20¨1，与5×蛋白上样缓冲液5¨l混匀后，在100℃水浴中变性5min，短暂离心，冷却
至室温。
⑥加样：在电泳装置的上槽和下槽中倒入蛋白电泳缓冲液，排除凝胶梳孔中的气
泡，用微量加样器依次在各个样品孔底部加样，每个样品孔上样量25肛l，蛋白Marker
点样孔点样10斗l。
⑦电泳：上槽接负极，下槽接正极，接通电源，恒压60V电泳，待溴酚蓝迁移
至浓缩胶下沿时，将电压调为90V，继续电泳，当溴酚蓝迁移至分离胶下沿时停止电
泳。
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(四)转膜
①电泳结束后小心取下凝胶，切取待测蛋白目标区，根据凝胶大小剪切PVDF
膜和滤纸。与凝胶大小一致的PVDF一角做好标记，将PVDF膜用甲醇浸泡15s，超
纯水漂洗2min，随后连同凝胶和滤纸放入电转缓冲液平衡15min。
②将whatmaJl滤纸三层铺于半干转印电泳仪的阳极碳板上，用转印液浸湿，用
玻棒充分排除气泡。然后依次放上PVDF膜、凝胶、Whatman滤纸，浸湿后排除气泡，
擦去多余水分，盖上阴极电板，90V恒压转印80min。
(五)W宅stemblot分析
(5)封闭、杂交和显色
①转膜结束后取下PVDF膜，用TBST洗膜5min×3次。
②将PVDF膜放入塑料袋中，加3ml封闭液，封口后室温下封闭60min。
③打开塑料袋，吸尽封闭液，加入用封闭液1：250稀释的一抗(山羊抗大鼠ICAM．1
多克隆抗体)，封口后4℃过夜。
④次日取出PVDF膜，TBsT洗膜5min×3次。
⑤将PVDF膜放入一新的塑料袋，加入用封闭液1：1000稀释的二抗(辣根酶标记
兔抗山羊IgG)，37℃孵育lh。
⑥取出PVDF膜，用TBST洗膜5min×3次。
⑦将膜置DAB显色液中显色，至有清晰条带显出时放入清水中终止反应。
(六)灰度值测定
PVDF膜上各杂交带经扫描仪扫描存入计算机，图像采用Quantity One软件分析。
蛋白含量以条带的0D值×面积(Int×删o)表示。
(十三)肝组织髓过氧化物酶(MPO)测定
按照南京建成生物有限公司髓过氧化物(MPO)测试盒提供的步骤操作。
(，十四)病理形态学检查
(1)取中叶肝脏组织切成1×1cm2左右，置于10％中性福尔马林液固定24h，送往
西南医院病理科常规行石蜡包埋切片，苏木苏一伊红(Hematoxylin．Eosin)染色。
(2)采用单盲法(观察的病理科医师不了解实验分组)行肝组织损伤评分，光镜下观
察肝组织病理形态的改变，每张切片各取5个视野(400×)。定量评分参考Heijnen等【2l】
的评分标准：①主要依据肝小叶结构改变、肝细胞变性坏死、炎性细胞(中性粒细胞)
浸润等。②评分标准：0分无；1分很少(少于细胞数的l％)； 2分偶尔见(有细胞
数的l～10％)；3分规则的(肝脏实质细胞的1～10％)；4分常见(肝脏实质的10～
19
第j’跃人学硕}。学位论史
50％)： 5分非常常见(人十肝Jil}!实质的50％)。
(1血)统计。乎处理
采Jfj sPss 13 0统计软件，计算均数(』)、标准差(s)，进行【F态性检验和力筹齐性
榆验，对符合I态分布和力茇齐性的资料进行尊闪袭方差分析(ANOVA)，组问组删阳
两比较采川q榆验(sNK法)。对小符合lr态分巾的资料计_舁：-I，位数(medlan，M)和叫分
化问距(quarnle，Qr)，进行非参数Kmskal—wallisp检验，组M比较采用Neme“yi法。
P<0 05表示差片其响统计学意义，P结果
1并组人鼠血清ALT和AsT水、卜的变化
PB—IR组人鼠I札清ALT，AsT酶水平较其他3组相比较明显刀高(p组的人鼠m清酶与sham组相比有l婀显增加，fH足较PB—IR组缸著降低(p‘0 05)，见表
2和图l。
表2 符组人鼠血清酶水’P(n一8，。+s)
PB—sham纰PB．【R卦1 Iso-sham组】so—IR组
ALT|lU，L) 40 63±20 03 I 88】5±545 80 50 5±15 82 1485 5±487 02’
竺：型!! !!：!!竺竺!：竺：!!!：坠生竺!型些!!!竺
’。PB．sham引比较，+p<0 05；’，PB-IR组比较，‘p<0 05
。■姐化一帅=勰一H
嶙姐
，二|■m
j曼眠
一埘
主；托
一洲
。。。o图m 各比
至_
㈣
∞
睢渤
2肝鲥l织中IcAM一1平¨TNF一ⅡmRNA转求水半变化
PB—IR自¨cAM l和TNF．Ⅱ基IN表达水甲(以内参照GAPDH进行校n：)明硅升
高(PH 1。
丧3再目【人鼠肝脏IcAM 1羽j TNF删RNA表达水平(，+s)
与PB—sham州比较， p<0 05：。，PB—lR组比较，’p*一
匍_]_
H 2脊组人鼠肿组纵山IcAM一
1
o PB．sham组比较， D午¨TNF?RNA表达变化
‘J PB—IR纽比较，’p<0 05
3肝组织IcAM一1免疫组化评分
PB—sham组和Iso—sham纽内皮细胞，盯细胞、·{·央静脉和小叶问静脉竹壁微弱表
达f附图3_a1 c)。PB—IR组内皮细胞、中央静脉和小叶问静脉管媾强表达，肝细胞少
晕微弱表达(附刚3_b)。Iso—IR纰nT见内皮细胞和盯细胞轻度表达，较Iso·IR组弱(附闭
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3一d)。免疫组化病理评分见表4。
表4各组大鼠肝组织内ICAM-1免疫组化评分(M(Qr)n_8)
与PB—Sh锄组比较，‘p4．肝组织ICAM一1蛋白质水平
PB．IR组特异性蛋白条带的积分光密度值为(222．50士1．41)，较其它三组明显增加
(p<0．05)。Iso-IR组(138．38士4．44)，较PB-Sh锄(119．75士3．85)组和Iso—Sham组
(“0．13士8．64)表达水平略增强，但是较PB．IR组明显减弱，且差异有统计学意义
(P<0．05)，见图3和附图2。
●ICA、王．1
图3．各组大鼠肝组织内ICAM．1水平变化
与PB．Sham组比较，+p<0．05；与PB—IR组比较，’p<0．05
5．肝组织内髓过氧化物酶(MPO)水平
Iso．瓜组大鼠肝组织内MPO与PB．Sham组和IS0．Sham组相比有明显增加，但是较PB．瓜
组显著降低Q0
0
0
0
0
0
约
如
圬
加
5
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表5各组大鼠肝组织内髓过氧化物酶(MPo)水平(了士s)
与PB．Sh锄组比较，+p●、叠o(U g)
PB—sh珊组船础Iso．sh锄组Iso．珏d丑
图4．各组大鼠肝组织内髓过氧化物酶(MPo)水平变化
与PB．Sh锄组比较，‘p6．HE染色肝组织病理学观察
PB．Sh锄组肝组织基本正常，汇管区基本正常，无明显增宽及纤维组织增生，无
炎细胞浸润(附图4．a)。PB．IR组多见局灶性肝细胞坏死，亦可见肝细胞凝固性坏死；
小叶周边区及中央静脉周围可见明显的肝细胞脂肪变性，肝血窦明显扩张、充血以及
较多中性粒细胞，肝索结构被破坏(附图4-b)。Iso．Sh锄组肝组织基本正常，汇管区无
明显异常，中央静脉增宽，肝血窦扩张(附图4．c)。Iso．IR组中央静脉和肝血窦稍扩
7
6
5
4
3
2
1
0
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张，淤血减轻。少量肝细胞变性，可见点状坏死，肝细胞脂肪变性，汇管区可见少量
中性粒细胞浸润，肝索结构基本正常存在(附图4．d)。各组评分结果见表6。
表6各组大鼠肝组织病理学观察评分(M(Qr))
与PB—Sh锄组比较，‘p讨论
1．实验设计的思考
常温下肝门阻断较短暂时间(20mim，发现术中及术后有不同程度的肝脏功能损害
发生。研究发现肝脏缺血再灌注后中性粒细胞聚集、活化释放毒性物质，致使组织局
部发生过度炎症反应是肝脏缺血再灌注损伤的主要病理变化。IR损伤过程中介导中性
粒细胞(PMN)和内皮细胞(EC)粘附聚集、迁移和活化的主要是细胞粘附分子家族，其
中ICAM．1和CDllb／CDl8起到重要作用倒。CDllb／CDl8为白细胞表面的分化抗原
之一，多表达于PMN表面。肝脏缺血再灌注期产生的TNF．Q，能够刺激PMN表达
CDllb／CDl 8123，24】。CDllb和CDl8形成异二聚体，与内皮细胞上的ICAM．1结合，介
导PMN黏附于内皮细胞，并通过CDllb／CDl8传递跨膜信息，促使PMN聚集、活化。
目前评价PMN在组织中浸润程度的可靠指标是中性粒细胞中含有的髓过氧化物酶
(MPO)。因此，ICAM．1、TNF．0【表达的高低和MPO反应活性可以反映肝脏IR损伤
引起的炎症反应程度。
我们研究小组先前的实验发现采用地氟烷预处理(1．O MAC，30min)能降低肝脏IR
损伤时自由基的含量，促进再灌注期间ATP的形成，Ca2+．ATP酶活性恢复，减轻肝
细胞内钙超载19J。其他研究亦证实吸入麻醉药预处理能对肝脏缺血再灌注损伤具有一
定的保护作用，且具有一定的普遍性【25‘281。近来研究发现吸入麻醉药能够抑制离体培
养的内皮细胞和PMN表面多种粘附分子如ICAM．1、VCAM．1和E．selectin等的表达，
推测抑制黏附分子途径可能是异氟烷肝脏保护作用机制之一【10。31。查阅文献提示，以
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往研究均选择离体灌注或者细胞培养为对象，即使进行在体研究也多为观察吸入麻醉
药预处理对异氟烷对肝脏瓜损伤的保护作用【6，7，9，25‘281。为此，我们设计并实施在体
进行异氟烷与肝脏瓜损伤的实验，研究IR期间使用异氟烷麻醉对肝脏功能的影响，
并检测肝组织ICAM．1、TNF—u基因表达变化和MPO的含量，来判断PMN的活性以
及肝脏损伤情况，探索异氟烷减轻肝脏损伤的可能机制。异氟烷广泛在临床麻醉中使
用，亦用于临床肝脏病患者的手术。因此，探讨异氟烷在肝脏缺血再灌注损伤保护方
面的作用，为减少围术期肝脏缺血再灌注损伤、寻找使用合理的麻醉药物提供理论依
据，具有一定的现实意义。
2．建立动物模型模型
针对建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤的多种动物模型，包括全肝缺血法、门体分流
法、原位灌注法、部分阻断血流法等[291，本研究采用的为目前较为广泛使用的大鼠常
温部分缺血再灌注损伤模型，此模型只是阻断了肝脏左、中叶的入肝血流，不阻断右
肝血流，造成约70％的肝脏缺血，最大的优点是可以防止发生严重肠系膜静脉淤血、
胃肠屏障功能损害引起内毒素学症诱发的全身血流动力学不稳定，对心血管循环影响
较小【l 51。因此，在此种模型中肝缺血再灌注是机体唯一的伤害性因素，并且此模型手
术方式操作简便，可重复性强，能够达到肝脏缺血再灌注损伤的效果，不会出现大鼠
因肝脏缺血时间过长，而在实验过程中死亡。黄施伟[25】等建立部分肝脏(约70％)缺血
再灌注模型，成功完成异氟烷预处理对大鼠肝血窦内皮缺血再灌注损伤影响的实验研
究。因此，大鼠部分肝脏(约70％)缺血再灌注模型适用与本相研究。
阻断入肝血流的安全时限目前仍不明确，但是长期以来临床工作中在常温下持续
阻断肝血流均以20min为限。整体肝脏缺血后一般用90min，再灌注60min；原位灌
注时多采用缺血120min，再灌注2h；在此期间，可以选择适当时间来检测相应参数，
一般来说，缺血2h常引起肝细胞不可逆损伤【291。有报道在缺血60min后仍有较高的
存活率达到60％，只是在热缺血120min大鼠存活率明显下降[30，311，Jaesclll(e【21等也证
实缺血60min肝脏再灌注后7天大鼠存活率为100％。以上研究说明大鼠能够耐受常
温下约70％肝叶缺血持续60min，所以本实验选择大鼠部分肝脏缺血60min这个时间点。
动物模型建立成功的依据：在采用小动脉夹闭后肝叶颜色肉眼观察由红褐色变为
暗灰色，缺血30min肝脏表面有肉眼可见的花斑状改变，60min后肝脏为灰白色，而
血供未受影响的右肝和尾状叶呈现鲜红色，充血，轻度肿大，肝包膜紧张，边缘饱满。
再灌注后缺血部分肝脏呈现紫灰相间的花斑状改变，然后逐渐转变为暗褐色。动物血
清血酶学检测结果和肝脏病理血检查均表明肝脏缺血再灌注成功。
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3．建立吸入麻醉模型
根据文献【ll，。7】所描述的麻醉方法并进行改进，具体步骤如下：将大鼠置于自制的
30×20×20cm的玻璃箱中，麻醉箱头端有一进气孔，尾部有一出气孔，可以连接麻醉
气体监测仪，箱底铺钠石灰。然后将Dreger麻醉机回路和大鼠麻醉箱进／出气口连接，
然后以2～5L／min氧流量流经异氟烷蒸发罐，蒸发罐开启浓度为2～3％，含麻醉药气
体流经麻醉箱，出气口连接Solar8000 M型麻醉气体监测仪，快速将箱内异氟烷浓度
达到1．4％，根据气体监测仪测定的异氟烷浓度调整挥发罐刻度，待箱内异氟烷浓度
恒定为1．4％时不再调整。大鼠持续吸入麻醉20min后待大鼠肺内麻醉药浓度和箱内
平衡后，迅速从箱内取出大鼠并将其口鼻部置于相同浓度的大鼠面罩内维持麻醉，同
时检测面罩内异氟烷浓度，同样继续维持在1．4％(参见附图7～9)。
异氟烷麻醉大鼠肺泡最小有效浓度(Minimal alve01ar concentration MAC)值的确
定：MAC反映吸入麻醉药的效价强度。有文献证实当麻醉箱内异氟烷浓度和大鼠肺
泡气异氟烷浓度达平衡后，存在一定的异氟烷浓度差，但差值较稳定【321。测定MAC
最好是采集肺泡气，但小动物应用异氟醚或其它血／气分配系数更小的吸入麻醉药，因
血液摄取对肺泡气药物浓度上升速率影响很小，吸入气和肺泡气麻醉药浓度的差异可
忽略不计【33】。因此，测定大鼠异氟醚MAC时常以吸入气异氟醚浓度代替肺泡气浓度
【341。本实验中以麻醉气体监护仪测定的麻醉箱内和大鼠面罩内最低有效浓度为指标，
来反映最低肺泡有效浓度(minimum alve01ar concentration)的变化。由于大鼠的年龄、
性别和体质，以及各研究中测定MAC方法细节的差异，文献中报道的异氟烷麻醉大
鼠后的MAC值也不尽相同。R锄pil[35】测得成熟雄性SD大鼠异氟烷MAC值为
(1．28±0．08)％；而Zucker【36】用3009左右的SD大鼠测得的MAC值为(1．60士O．01)％；
刘东【37】等测定成年雄性SD大鼠、体重190～2309的基础MAC为(1．53土O．05)％；靳艳
卿[17]等用250一3009左右SD大鼠测定麻醉箱内最低有效浓度为(1．44土O．16)％。
目前异氟烷是临床中使用的最为广泛的吸入麻醉药，其对缺血再灌注损伤的保护
作用已经在心肌、脑、肝脏以及肾脏等重要脏器得到证实，具有一定的普遍性。国内
外的均报告1．O MAC的异氟烷能够对肝脏具有保护作用【25，26】。综合文献报道中的结
论，本研究中采用成年雌性SD大鼠体重250～3009，在实验过程维持大鼠面罩内的
异氟烷浓度在1．4％，相当于1．O MAC。
4．实验的质量控制
在本实验过程中，对影响实验结果的各种环节均进行了严格的控制。
由于肝组织中含有大量丰富的内源性生物素，本实验中免疫组织化学染色采用的
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是PowerVisionllM两步法。两步法检测系统是在一条稳定的氨基酸骨架上将多个辣根
过氧化物酶(HRP)和Fab段(抗原结合片段)结合在一起形成多聚物，替代传统方法中
的二抗和三抗，直接放大抗原抗体信号，这种多聚物Fab段使其具有对一抗很强的亲
和性，而多个HRP分子又使其具有很高的灵敏度。由于不使用生物素和链霉卵白素，
并且使用的只是抗体的抗原结合片段，因此，可以完全避免内源性生物素和Fc受体可
能造成的背景染色，使两步法具有假阳性率低和背景低的特点【3引。两步法比传统的SP
法减少了两个步骤，另外由于PicTureTM两步法背景染色非常干净，因此去掉了传统
方法中的血清封固，使得这种方法更加快速和易于使用，比SP法至少节省90 min。实
验结果显示，背景染色比较干净，非特异性染色较少，阳性产物明显突出，结果易于
判断。评分和分级由病理科医师进行。
RT—PCR实验中①动物实验结束取的肝组织迅速放入液氮中保存；②用于RNA提
取以及RT．PCR反应实验中所用的EP(Eppendof)管，微量移液器枪头等均经过DEPC
浸泡过夜去除RNA酶，然后高温高压蒸汽消毒；③采用液氮研磨的方法提取肝组织
总RNA，并立即实施反转录或PCR实验，尽可能减少污染而导致的降解。
RT—PCR检测基因表达以及westem blot检测蛋白表达量均属于半定量指标，对于
实验结果的分析采用凝胶定量软件Quantity One中的泳道／条带轨迹定量法(Trace
Tracking)，虽然该法使用起来步骤较为繁琐，必须通过泳道识别——电泳条带识别两
个连续的步骤才能进行定量，然而这种方式的最大优点在于它可以完全抛弃人为主观
因素进行全自动定量。首先能够最大程度的排除不同泳道之间的背景差异，让各个泳
道上的不同电泳条带在一条几乎相同的起跑线上进行对比。然后根据不同电泳条带的
光密度值绘制光密度曲线，然后计算光密度曲线下面积作为电泳条带的定量根据。
实验所用的玻璃器具均进行泡酸处理后高温消毒。所有配制试剂均采用专用器皿，
需要冷藏保存的随时放入冰箱。检测时对所用实验仪器进行校准，最大限度的消除系
统误差；每次实验各组同时进行，最大限度的消除随机误差，实验结果的检测和分析
尽可能采用盲法，减少人为误差。
5．异氟烷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用
本项实验中在成功完成动物实验后，我们首先检测血清ALT和AST，作为评价缺
血再灌注后肝脏损伤的标志物，血清ALT和AST能够准确反映肝细胞的损伤程度。
结果显示戊巴比妥钠麻醉大鼠肝脏热缺血60min再灌注3h后血清AST，AST酶水平
与其他三组相比较明显升高；如果在缺血再灌注期间同时接受异氟烷麻醉，实验终点
大鼠血清酶与假手术组相比虽然明显增加，但是戊巴比妥钠麻醉的缺血再灌注组显著
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第三军医大学硕士学位论文
降低，这提示异氟醚在肝脏缺血再灌注期间确实减轻缺血再灌注造成的肝脏损害。
光镜下观察形态学(HE染色)改变，作为对照的两个Sh锄组肝组织结构基本正常。
在发生缺血再灌注情况时，采用Iso麻醉较PB麻醉可以减轻中央静脉和肝血窦稍扩张，
淤血。肝细胞变性和坏死减少，汇管区可见少量中性粒细胞浸润，肝索结构基本正常
存在。总之整体表现为Iso．IR组的肝组织病理损害明显轻于PB—IR。从以上两个研究
结果看，异氟烷可以有效增强大鼠肝脏对IR损伤的耐受性，能降低因瓜导致的肝脏
损伤。这与Hiroshi I【2 61、黄施伟【251以及张健【27】的研究结论相一致。
6．异氟烷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤时ICAM—l的影响
ICAM．1属于细胞粘附分子中的免疫球蛋白超家族成员，又称为CD54。在正常肝
组织，血窦内皮细胞和肝细胞膜仅有微弱ICAM．1表达，病理状态下如：肝纤维化，
缺血再灌注时表达增加。Banga等【3】研究证实再灌注时相ICAM．1在中性粒细胞粘附、
聚集以及活化过程中起关键作用。活化的中性粒细胞释放蛋白水解酶和活性氧原子产
生继发性肝细胞损害。因此肝脏缺血再灌注损伤的核心是炎症反应，体循环中性粒细
胞的浸润介导肝细胞损伤。
免疫组化染色显示实验中没有接受缺血再灌注的两组大鼠肝组织内皮细胞仅有少
量ICAM．1表达，但是在缺血60min再灌注3h肝组织血窦内皮细胞着色呈现强阳性，
ICAM一1在肝组织内表达明显增加，与Kobayashi等【24]研究结果一致；如果在缺血再
灌注期间用异氟醚处理后发现ICAM．1较采用戊巴比妥钠麻醉组表达水平明显降低，
但较其他两个假手术组明显增加。进一步用RT-PCR和westem blot等实验方法验证免
疫组化实验，戊巴比妥钠麻醉大鼠肝脏缺血再灌注后ICAM一1的基因转录和蛋白表达
明显增加，异氟烷较戊巴比妥钠明显抑制大鼠肝脏缺血再灌注后ICAM一1的基因转录
和蛋白表达。通过上述的研究反映出ICAM一1在缺血再灌注损伤的过程中在多种因素
作用下被活化；卤代烷类吸入麻醉药异氟烷在临床使用浓度(1．O MAC)能抑制肝组织
ICAM．1上调。
7．异氟烷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤时TNF．Q和MPO的影响
肝脏缺血时产生的各种促炎细胞因子，最主要的有TNFC【、和IL．1等。再灌注初
期TNF．G【主要由被激活的巨噬细胞或单核细胞所产生。肝脏KC为体内最大的固定巨
噬细胞池，具有产生TNF一0【的巨大潜能，是产生TNF一仪的主要部位。KC拥有补体受
体，肝脏缺血、再灌流初期释放大量细胞内蛋白，激活补体，激活的补体刺激KC活
化，活化后的KC能分泌释放TNF—Q进入血液中。研究证实核因子．1(B(NF．KB)与肝脏
缺血再灌注后炎症反应包括细胞黏附分子的合成与表达关系密切【3引。正常情况下
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NF—KB位于细胞浆内受抑制性蛋白11(B家族的调控，在某些条件刺激下(如氧化应激、
TNF—Cc等)，11(B被磷酸化导致失活并与NF．KB解离，使得后者发生易位转入细胞核内
并与特定的DNA序列结合，从而发挥调节转录炎症因子的作用。我们通过测定肝组
织中的TNF—Q mRNA，发现肝脏再灌注3h时其转录水平增加，与ICAM一1的表达趋
势相一致，反映了二者在此病理过程中的密切关系。TNF．a能够刺激中性粒细胞(PMN)
表达LFA一1(CDlla／CDl8)和Mac．1(CDllb／CDl8)吲。我们推测肝脏缺血再灌注期间
产生的TNF—Cc刺激体循环PMN，使其膜表面CDll／CDl8表达增加。CDll／CDl8属于
白细胞黏附分子D2亚家族，主要通过与内皮细胞膜上配体ICAM一1结合，在PMN对
内皮细胞黏附和功能发挥过程中起到重要作用[24，401。因此，再灌注期肝脏内黏附分子
增加的情况下可能导致PMN增加。我们通过测定肝组织中MPO水平间接反映肝脏中
PMN的数量。MPO是主要存在于中性粒细胞中的嗜天青颗粒，其活性是评价中性粒
细胞在组织中浸润程度的可靠指标。结果发现再灌注3h后MPO活性升高，提示肝组
织中PMN浸润，经异氟烷麻醉能够明显减少MPO活性，PMN浸润程度减轻，说明
采用异氟烷麻醉能够抑制再灌注期肝脏中PMN的浸润、减轻炎症反应来拮抗肝脏瓜。
根据上述实验结果推测异氟烷抑制PMN浸润可能是抑制ICAM一1途径实现，TNF—Q
在刺激黏附分子表达增加过程中起到重要作用。
8．实验设计的反思和展望
查阅文献提示异氟烷对肝脏缺血再灌注损伤保护作用的研究，国外研究主要为离
体研究，给药方式多为全程灌注【7’2引。国内进行在体研究异氟烷对肝脏m损伤的保护
作用，张健【271等主要是从肝药酶和胆红素的变化角度说明；黄施伟㈣等主要从肝血窦
内皮的角度证明；我们研究小组【9】早期的研究主要是从抑制氧自由基，减轻钙超载的
角度进行研究。虽然上述研究均进行了异氟烷对肝脏瓜损伤保护作用的研究，但是研
究的着重点集中在异氟烷预处理。本实验中，我们则从缺血再灌注全过程采用异氟烷
麻醉的角度证实异氟烷对大鼠常温肝脏缺血再灌注损伤以及黏附分子的影响。
本研究中，我们选取的指标包括ALT和AST以及形态学的观察，观察到1．O MAC
异氟烷能够明显减轻对大鼠常温肝缺血再灌注损伤。进一步研究发现缺血再灌注期间
连续应用异氟烷麻醉不仅减少ICAM．1和TNF．0L表达，同时减少肝组织中MPO活性。
以上实验结果提示：异氟烷保护肝脏缺血再灌注损伤的机制可能通过抑制黏附分子途
径减轻中性粒细胞引起的炎症反应实现。这一实验结果与Lee等【41】在肾脏缺血再灌注
研究中取得的研究类似。
我们在实验中没有直接检测体循环内中性粒细胞膜表面的CDl8水平，只是通过
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检测TNF．a间接反映白细胞黏附分子p2亚家族的表达；在实验过程中也没有对血清
和组织中的其他炎性因子的进行检测；异氟烷减少PMN在肝组织聚集是否与其对中
性粒细胞激活的直接抑制作用有关[42】?另外，由于肝脏内有多种细胞共存，缺血再灌
注期间异氟烷对细胞起到的作用可能是共同作用的结果；此外，在实验中不能排除夹
闭肝动脉、门静脉以及异氟烷麻醉对肝脏局部血流和全身血流动力学的影响；由于我
们只是选取再灌注3h这一时间点进行研究，而对于更长时间的再灌注的损伤的影响仍
需要进一步的探讨。新近研究发现ICAM一1与细胞内谷胱甘肽(GSH)含量的调节有关H 3’
4引。谷胱甘肽可直接消除多种自由基，还可以与白细胞在氧应激时产生的髓过氧化酶衍
生氧化物如次氯酸、氯胺等反应，阻止其进一步参与氧自由基生成反应。吸入麻醉药能
维持肝脏IR期间的GSH含量p1，那么吸入麻醉药麻醉大鼠肝脏IR损伤期间GSH产量
与工CAM一1是否有关目前尚未见报道。因此，需要在今后的研究中采用离体细胞实验的
方法，来探讨异氟烷对内皮细胞和肝细胞缺氧复氧损伤的影响，作为整体实验的补充
和机制的进一步探讨。
结论
1．常温下对大鼠行70％的肝脏血流阻断60min、再灌注3h期间采用异氟烷(1．O
MAC)麻醉较使用戊巴比妥钠麻醉明显减轻血清ALT和AST。
2．戊巴比妥钠麻醉大鼠肝脏缺血再灌注后ICAM一1的基因转录和蛋白表达明显
增加。
3．异氟烷较戊巴比妥钠明显抑制大鼠肝脏缺血再灌注后ICAM．1的基因转录和
蛋白表达。
4．戊巴比妥钠麻醉大鼠肝脏缺血再灌注后TNF—Oc的基因转录明显增加，异氟烷抑
制TNF．Q的基因转录。
5．戊巴比妥钠麻醉大鼠肝脏缺血再灌注后肝组织髓过氧化物酶(MP0)活力增加，
异氟烷较戊巴比妥钠抑制大鼠肝脏缺血再灌注后MP0的活力。
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致谢
本课题是在导师陶国才教授三年来精心指导下完成的。在课题的选题、设计及具体
实施过程中，都得到他的悉心指导、鼓励和帮助。在我这三年的学习过程中，导师高
尚的道德品格、严谨的科学作风、敏锐的科研思维、不断进取和开拓创新的精神、渊
博的学识和崇高的敬业精神一直激励、鞭策着我，给我留下了深刻的印象，我将永远
以他为榜样，努力走好将来的医学之路。导师不仅在学习工作上对我悉心教导，生活中
也给予我亲切的关怀和无私的帮助。值此毕业论文答辩之际，谨向精心培养我的恩师
致以最诚挚的感谢和最衷心的祝愿!
在本课题的具体实施过程中，得到了西南医院中心实验室全体老师以及我科实验
室老师和同学的热情帮助，衷心感谢毕敏教授、鲁开智副教授、聂发传副教授对我工
作和实验的无私指导和热情帮助。感谢易斌博士、崔剑硕士、顾健腾硕士、文欣荣硕
士、陈杰硕士、苏东硕士、王秀琼硕士、何静硕士、王金宝硕士，李玉萍硕士在实验
方面的帮助和有益探讨。特别感谢易斌博士、崔剑硕士、顾健腾硕士、何静硕士、王
金宝硕士在课题设计、实验研究、论文撰写等方面的热情帮助。
特别感谢我的家人多年来对我的工作和生活的照顾和关心。
最后，谨向在本课题完成过程中支持、关心和帮助我的其他领导、老师和同事表
示最诚挚的谢意!
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日召
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附图1各组大鼠肝组织内IcAM一1
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和TNF吨表达RT-PcR电泳图
■■105KD
- j 懈75 KD
PB-shaTTl组PB—IR组Iso—sh啪组Iso—IR组M诎
附削2再组人鼠肝组织内lcAM—l水平(westem bh)
附图3_a IcAM一1免疫组化染色rx400)：PB—sh锄组
————————————————苎三兰垦查兰堡主堂垡丝苎
附图3-d IcAM一1免瘦组化染色(x400)：Iso_IR组
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附图4．a肝组织病理学观察(HE×400)：
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附图5大鼠肝脏解剖附图6_a小动脉夹准备夹闭肝动脉和门静脉左支
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谬’
附图6_b小动脉夹夹闭肝动脉和门静脉左支
附图9_d采用大鼠面罩麻醉附图9-f麻醉机和面罩连接麻醉大鼠
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文献综述
全身麻醉药物抑制黏附分子与器官保护作用
粘附分子是指由细胞产生，可促进细胞与细胞间、细胞与细胞外基质问相互接触
和结合的一类膜表面糖蛋白的总称，在维持细胞结构完整和细胞信号转导中起重要作
用。近年来研究发现，粘附分子在缺血再灌注时介导中性粒细胞(PMN)的聚集，后者
是缺血再灌注损伤的重要机制之一。全身麻醉药物对不同器官缺血再灌注损伤(IRI)均
有一定程度的保护作用【1，2】。本文旨在介绍目前关于粘附分子，粘附分子在缺血再灌注
损伤中的作用，以及全身麻醉药物与该分子关系的研究进展。
1．粘附分子的分类及功能
目前研究发现的粘附分子有5大类，分别是免疫球蛋白家族、整合素家族、选择
素家族、钙粘着糖蛋白家族、其他未分类的分子。
免疫球蛋白家族主要包括细胞间粘附分子．1、细胞间粘附分子一2以及血管细胞
间粘附分子一1(VCAM一1)，它们均介导了白细胞和内皮细胞的粘附，并与整合素家族的
成员互为受体一配体。ICAM—l主要分布于血管内皮细胞表面，正常情况下表达水平较
低或不表达，缺血后内皮细胞激活其表达量迅速上升，ICAM．1在EC激活后1小时内
开始增高，8小时达到高峰，至少7天内保持高水平【3】，与白细胞表面D2．整合素受体
相结合，介导白细胞的紧密黏附及游出【4J。
整合素家族是由Q链和B链以非共价键构组成细胞表面的异二聚体蛋白。根据
p链的差异分为pl，p2，p3等亚族，各亚族的p链可结合不同的0【链。p1亚族主要是
极迟反应抗原(very 1ate antigens VLAs)；p2亚族，也称为CDl8，表达于白细胞表面，根
据cc链的不同分为淋巴细胞功能相关抗原．1(LFA．1)、巨噬细胞分化抗原．1(Mac．1)和
GPl50／95；B3亚族包括血小板GPIIb／IIa复合体、CD41／CD61等。CDl8在细胞膜上
表达数量与细胞是否被激活有关，LPS、TNF和IL一1等均可以引起PMN脱颗粒，在
10～30min内把CDl8动员至细胞膜表面【5I。
选择素家族是一组含植物血凝素一表皮生长因子．补体样结构的粘附糖蛋白，包
括L．选择素、E一选择素和P．选择素，主要参与白细胞的滚动粘附。L．选择素分布于各
种白细胞的表面，其介导的滚动粘附无需白细胞的活化。E一选择素主要位于毛细血管、
后微静脉的内皮细胞上，属可诱导性粘附分子，仅表达于活化的内皮细胞表面，E．选择素
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在EC激活30s内开始表达增加，4～6小时达高峰，24小时后逐渐消失。P．选择素又
名GMP．140，位于血小板O【颗粒和内皮细胞的WP小体中，当细胞被组胺、凝血酶、
氧自由等激活后，P一选择素迅速转移至细胞表面，介导中性粒细胞的滚动粘附，在炎症
早期发挥重要作用。
钙粘着糖蛋白家族是一类结构和功能相似的单链跨膜糖蛋白组成，主要分为
E一(上皮)、P．(胎盘)、和N．(神经)3种，分子量均为120KD，具有不同免疫特异性。
钙粘着糖蛋白促进细胞间粘附的机制主要是把与自身相同的其他钙粘着糖蛋白分子作
为配体。主要参与介导钙离子依赖的同型细胞间的粘附，其特点是既可作为受体，又
可作为配体，按嗜同类结合方式而相互结合。以分子的胞质内末端与膜内面粘着斑蛋
白(catenins，u一、p．、丫．)及细胞骨架肌动蛋白组装形成粘合连接分子复合体结构，是介
导细胞间粘合及信号转导的功能单元，对细胞识别、迁徙、归类行为及在维持正常组织
结构方面起着重要作用，参与调节组织发生和形态分化【61。
2．细胞粘附分子在取I过程中的作用
不同器官的组织细胞对粘附分子的表达不同，正常情况下均有少量的表达，但瓜I
时粘附分子均有不同程度的上调，其中参与IRI的粘附分子主要包括：免疫球蛋白家
族、整合素家族、选择素家族。取I过程中细胞粘附分子主要是介导PMN．EC粘附、
迁移和活化。缺血时释放的各种细胞因子、趋化因子及各种炎性介质分别导致PMN
和EC激活，使二者表达粘附分子。PMN．EC粘附是多种黏附分子参与的复杂过程。
首先是缺血使EC表面P．选择素表达增加，其和PMN表达的p．选择素糖蛋白
-1(P-selectin 91yc叩rotein—l PGSL一1)相互作用，使PMN在血管壁上“滚动”，其次PMN
表达的CDll／CDl8和EC持续表达的ICAM．1紧密的粘附令PMN在血管壁的运动停
止，接着在EC连接处持续表达的血小板．内皮细胞黏附分子．1(platelet_endothelial cen
adhesion molecule一1)的作用下PMN迁移至血管外的组织间隙。这时活化的PMN释放
毒性的活性氧物质、蛋白水解酶和胰蛋白酶，最终导致加重微循环障碍、组织水肿、
血栓形成和实质细胞的死亡Ⅳ舄J。
3．全身麻醉药物抑制黏附分子与器官保护作用
近几年的研究证实大部分麻醉药物可以抑制粘附分子的表达，推测这与吸入麻醉
药的器官保护机制之一。以下分别介绍不同的麻醉药物对粘附分子的作用。
3．1挥发性吸入麻醉药
Rossi等H用人外周血分别和0．5MAC或1．OMAC的异氟醚共培养在未加入刺激因
素N一甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸(FMLP)发现异氟醚显著减少淋巴细胞PSGL一1的表达，
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而对选择素和p2．inte鲥ns没有影响；在加入刺激因素(FMLP)后两种浓度的异氟醚能减
少淋巴细胞表面的PSGL．1，而1MAC的异氟醚只能抑制CDlla的表达，对细胞表面
L．选择素和CDllb没有影响。在另一项早先类似的研究中发现异氟醚能抑制外周血
中性粒细胞表面的L．选择素、CDlla和CDllb的表达，推测异氟醚减少IRI可能通
过抑制中性粒细胞表面粘附分子的表达降低和内皮细胞的粘附，减少中性粒细胞的聚
集活化【10】。zhu等【11】用1．O MAC的地氟醚预处理人脐静脉内皮细胞(HUvEC)60min
后加入刺激因素TNF．0【观察地氟醚对HUVEC黏附分子的影响，发现地氟醚不仅能够
减少TNF．0【刺激HUVEC表达的ICAM．1和E．选择素蛋白而且减少了ICAM．1和
VCAM．1 mRNA的表达，同时发现用地氟醚处理的HUVEC能明显降低中性粒细胞的
粘附率，并且降低中性粒细胞的粘附和减少黏附分子的表达是相关的，认为在中性粒
细胞聚集过程中地氟醚影响了黏附分子的表达，推测地氟醚减少球I和抑制介导中性
粒细胞与血管内皮细胞紧密粘附ICAM．1、VCAM．1和E．选择素等粘附分子密切相关。
通过上述体外进行的多项研究证实吸入麻醉药能够抑制内皮细胞和中性粒细胞膜表面
的粘附分子表达，推测吸入麻醉药可能是通过抑制内皮细胞和PMN表面的粘附分子
表达从而减少PMN在瓜I组织中的聚集、活化，起到减轻器官损伤的作用。
广泛在临床中使用的麻醉药物中，吸入麻醉药对缺血再灌注损伤的保护作用已经
在心肌、脑、肝脏、肾脏等重要脏器得到证实，其作用具有一定的普遍性【l，2】。Lee等
[12]在以静脉麻醉药(戊巴比妥、氯胺酮)为对照的大鼠。肾脏缺血再灌注模型中发现吸入
麻醉药减少ICAM．1 mRNA和蛋白质的表达，同时减少了致炎性细胞因子(TNF．仪、IL一8)
和化学增活素(MCP一1、Mp．2、IP．10)的表达，证实吸入麻醉药确实通过减弱炎症反应
而对肾脏起保护作用。孙瑛等【1 3】建立在体的大鼠肺IRI模型观察吸入20 ppm NO和
(或)1．3 MAC地氟醚预处理对大鼠肺瓜I的作用，发现吸入NO和地氟醚均可在一定
程度上抑制肺瓜后IL一1 B和TNF．0【的生成，降低ICAM．1的上调，减少MDA和MPO
生成，同时抑制IL．10生成，认为吸入地氟醚和(或)NO抑制促炎细胞因子以及黏附
分子的表达，同时对抗炎因子也有明显抑制作用，对肺取损伤起到保护作用；但两者
联合应用并未呈现显著的协同作用。在对离体豚鼠心脏缺血再灌注损伤的研究中显示
吸入麻醉药减少PMN在再灌注后冠脉系统的粘附而保护心功能，七氟醚和异氟醚心
脏保护作用可能是通过减少PMN的CDllb的表达【14】。黄施伟等【15】以及我们研究小组
【16】发现无论是采用异氟烷预处理还是麻醉大鼠行肝脏缺血再灌注后均能降低ICAM一1
表达，推测可能是异氟烷增加再灌注损伤器官耐受性的机制之一。
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3．2静脉麻醉药
静脉麻醉药中研究最多的是异丙酚，其次是氯胺酮．王月兰等[”】应用流式细胞仪
测定不同时间点的血中性粒细胞黏附因子(CDllb)表达量。并于肝门阻断前、开放后
30分钟、60分钟取无瘤肝组织采用RT．PCR方法测ICAM．1基因表达，观察围术期
异丙酚麻醉对肝脏缺血再灌注损伤时的中性粒细胞黏附因子的影响，发现异丙酚可减
少血液中CDllb产生，可预防或减轻PMN的黏附与浸润。吕湘琪等【18】在大鼠肺脏ⅡU
的模型研究中发现麻醉剂量的异丙酚抑制PMN CDl8的表达和呼吸爆发，肺瓜损伤，
保护肺功能。在另一项研究中发现异丙酚能够减轻肢体缺血再灌注期间血清中
ICAM．1，对肢体缺血再灌注具有一定的保护作用【19】。
Weigand等【20】研究发现氯胺酮浓度依赖性抑制FMLP和豆蔻酸诱导PMN表面
CDl8的表达和L一选择素(CD62L)的脱落，这种抑制作用在氯胺酮的两个异构体S(+)
和R(．)型对于CDl 8抑制作用的立体选择性方面不存在实验差异，提示这种抑制作
用不是通过特异性受体介导的。在另一项研究中，培养HUVEC后加入刺激因素
TNF．c【(2．5ng／m1)同时在加入或不加入氯胺酮共培养4h后观察氯胺酮对HUVEC黏附分
子的影响，发现氯胺酮(O．5、5 mM)对TNF．G【诱导的ICAM．1和E一选择素(E．selectin)
表达没有抑制效应，但是减少了CDllb的表达。因此氯胺酮的抗炎作用主要是通过抑
制淋巴细胞的活动，而对内细胞粘附分子的表达没有影响【2¨。
目前大多数研究都证实了挥发性吸入麻醉药、异丙酚和氯胺酮等全麻药物，在临床
麻醉剂量浓度范围内就可以直接抑制粘附分子的表达，并认为吸入麻醉药可能是通过
抑制内皮细胞和PMN表面粘附分子的表达从而减少PMN在IRI组织中的聚集、活化，
起到减轻器官损伤的作用。上述实验结果大多数是利用离体培养细胞或是离体灌注模
型所获得的，这不符合实际使用情况。随着分子生物学的发展，实验方法和技术的改进，
将会进一步明确各种粘附分子功能，阐明全身麻醉药物对于不同粘附分子的作用方式
和效果，这将深化我们对麻醉药物抗炎机制的认识，为正确使用这些药物，合理解释它们
的临床作用现象提供理论依据。
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研究生学习阶段发表的文章
1．徐广民，陶国才，易斌．异氟烷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤时细胞间黏附分子一1表
达的影响．第三军医大学学报，2008，30(3)：241-243
2．徐广民，陶国才．术后谵妄。实用医学杂志，待发表
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异氟烷对大鼠缺血再灌注损伤肝脏ICAM-1表达及中性粒细胞
浸润的影响
作者：徐广民
学位授予单位：第三军医大学
相似文献(10条)
1.期刊论文徐广民.陶国才.易斌.XU Guang-min.TAO Guo-cai.YI Bin 异氟烷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤时细胞间
黏附分子-1表达的影响-第三军医大学学报2008,30(3)
目的研究异氟烷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后细胞间黏附分子-1 (ICAM-1) 的影响,探讨异氟烷肝脏缺血再灌注保护作用的机制. 方法将32只SD成
年雌性大鼠分为假手术组、缺血再灌注组、异氟烷组、异氟烷-缺血再灌注组.假手术组、异氟烷组作为对照;缺血再灌注组和异氟烷-缺血再灌注组阻断
支配大鼠肝脏左叶和中叶的门静脉分支,建立肝脏70%缺血再灌注模型,缺血60 min再灌注3 h后取材,测定大鼠血清ALT、AST;免疫组织化学方法检测ICAM-
1 蛋白的表达,HE 染色进行病理学检查.结果肝脏缺血60 min再灌注3 h后肝组织ICAM-1 蛋白表达水平增高;血清酶ALT 和 AST 升高;肝组织损害严重
.异氟烷抑制 ICAM-1 表达,降低 ALT、AST 水平,减轻肝细胞损伤.结论肝脏缺血再灌注损伤程度与肝组织内 ICAM-1 水平有密切的关系,异氟烷可抑制
肝脏缺血再灌注期间肝组织ICAM-1 的表达,同时减轻伤肝脏损伤.
2.学位论文张素品异氟烷/七氟烷预处理及后处理对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用 2009
目的：目前肺缺血再灌注损伤仍然是困扰心胸外科手术的难题，有关其防治措施的研究尚未获得理想进展。麻醉药物的应用是围手术期的重要环节
，已有研究发现卤族类吸入性麻醉剂预处理对肺缺血再灌注损伤具有保护作用，但仍有争议，有关其后处理作用的研究较少，所以深入研究常用卤族类
吸入性麻醉剂对肺缺血再灌注损伤的影响具有重要的临床意义。本研究采用大鼠原位肺缺血再灌注损伤模型，探讨异氟烷、七氟烷预处理及后处理的肺
保护作用，以期为临床合理选择麻醉药物提供理论依据，为麻醉药物脏器保护作用的深入研究开辟思路。
方法：SPF级SD大鼠180只，随机分为6组（n=30）。①假手术组（C组）：开胸游离左肺门后，未予阻断；②缺血再灌注组（I/R组）：阻断左肺门
45min，而后松开血管夹形成缺血再灌注；③异氟烷预处理组（ISO-Pre组）：持续吸入1MAC（1．4%）异氟烷30min后，阻断左肺门45min，然后松开血管
夹形成再灌注；④异氟烷后处理组（ISO-Pos组）：阻断左肺门45min，在恢复灌注同时，以麻醉机吸入1MAC异氟烷30min；⑤七氟烷预处理组（SEVPre
组）：阻断前吸入1MAC（2．1%）七氟烷30min；⑥七氟烷后处理组（SEV-Pos组）：在恢复灌注同时，以麻醉机吸入1MAC七氟烷30 min。各组均于再
灌注0min、30min、60min、120min、240min共5个时点分别处死动物6只，留取动脉血、肺组织和肺泡灌洗液标本，测定动脉血氧分压，肺泡灌洗液中炎
性细胞计数、中性粒细胞百分比和蛋白含量，肺组织髓过氧化酶、细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6的浓度和细胞凋亡指数，肺泡灌洗液中细胞因子TNF-
α、IL-1、IL-6和表面黏附分子CD11b、CD31、CD54和CD62L的表达变化；并行光镜、电镜观察肺组织病理形态学改变。
结果：I/R组、ISO-Pre组、ISO-Pos组、SEV-Pre组和SEV-Pos组均随着再灌注时间的延长表现出明显的肺损伤变化，动脉血氧分压下降，肺组织
MPO，TNF-α、IL-1、IL-6，细胞凋亡指数，以及肺泡灌洗液中炎性细胞计数、中性粒细胞百分比和蛋白含量均明显增高，TNF-α、IL-1、IL-6和表面黏
附分子CD11b、CD31、CD54和CD62L的表达增加。与C组、I/R组相比，异氟烷组和七氟烷组各项观察指标在不同时间点均存在统计学差异。异氟烷组和七
氟烷组相比无显著差异。病理切片显示，I/R组肺泡和肺间质内白细胞聚集成团，肺泡结构破坏，间隔增宽，肺泡腔严重出血水肿，肺损伤较异氟烷组和
七氟烷组更加严重。透射电镜也显示I/R组Ⅱ型肺泡上皮细胞板层小体空泡化，线粒体结构破坏，其改变与异氟烷组和七氟烷组存在差异。
结论：卤族类常用吸入性麻醉剂-异氟烷、七氟烷预处理和后处理均能减轻大鼠肺缺血再灌注损伤，具有明确的肺保护作用。其对再灌注后肺组织损
伤的保护作用可能是通过抑制炎症反应，减少中性粒细胞的浸润、粘附与迁移，降低肺组织细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6的表达与释放，下调肺缺血再
灌注损伤所致黏附分子CD11b、CD31、CD54、CD62L等的表达，进而减少PMN在肺内炎症部位的聚集，降低肺组织的通透性，减少肺组织细胞-特别是肺泡
Ⅱ型上皮细胞的凋亡而实现的。不同的卤族类吸入性麻醉剂-异氟烷与七氟烷，不同的处理时机-即预处理与后处理，其所产生的对肺缺血再灌注损伤的
保护作用大致相似，推测可能是通过相似甚或相同的作用机制发挥肺保护作用。
3.期刊论文丁国友.邓爱琴.帅君.DING Guo-you.DENG Ai-qin.SHUAI Jun PKCγ对异氟烷预处理抗大鼠脑缺血再灌
注损伤的影响-江西医学院学报2008,48(4)
目的探讨异氟烷预处理抗脑缺血再灌注损伤过程中蛋白激酶γ(gamma of protein kinase C,PKCγ)在细胞膜和细胞浆内转位中的动态变化规律.方
法采用大脑中动脉线拴方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型.72只SD大鼠随机分为3组:假手术组24只,根据再灌注后各时间点不同又分为再灌注后4、
24、72 h组,每组8只.缺血再灌注组、异氟烷预处理组,每组24只,根据缺血再灌注后时间点不同又分为缺血再灌注后4、24、72 h组,每组8只.假手术组分
别在再灌注后4、24、72 h处死大鼠,取大鼠额叶皮质;缺血再灌注组大鼠前脑缺血2 h后,分别在再灌注后4、24、72 h处死大鼠,取大脑额叶皮质;异氟烷
预处理组于缺血前1.5 h经半密闭的吸入箱吸入1.5%异氟烷,持续1、0.5 h后制备脑缺血再灌注模型,其余同缺血再灌注组.各亚组大鼠大脑额叶皮质细胞
浆和细胞膜上的PKCγ含量用免疫印迹(Western blot)法测定.结果与假手术组的再灌注后4、24、72 h组比较,缺血再灌注组和异氟烷预处理组的同时间
点组细胞膜上PKCγ水平均有显著升高(P均＜0.05)、在细胞浆中的PKCγ水平均有显著减少(P均＜0.05).异氟烷预处理组的缺血再灌注后4、24、72 h组
PKCγ水平均较缺血再灌注组的同时间点组在细胞膜上显著升高(P均＜0.05)、在细胞浆中的PKCγ水平均有显著减少(P均＜0.05),且异氟烷预处理组的缺
血再灌注后24 h组PKC7水平为最高.结论异氟烷预处理可增加大鼠大脑额叶皮质PKCγ向细胞膜转位;PKCγ膜转位可能有利于大鼠脑的缺血再灌注损伤.
4.期刊论文曹国辉.CAO Guo-hui 丙泊酚-瑞芬太尼靶控静脉麻醉对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用 -四川医学
2009,30(8)
目的探讨丙泊酚-瑞芬太尼靶控静脉麻醉对肝脏部分切除术缺血再灌注损伤的影响.方法 40例患者随机分为丙泊酚-瑞芬太尼组和异氟烷组.分别于
术前(T0)、麻醉诱导后(T1)、肝门阻断开放后10min(T2)、30min(T3)和60min(T4)取静脉血测定谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨瞬(ALT)、谷氯酰转肽酶、总
胆红素等代谢指标,并测定血清总超氧化物歧化酶(T-SOD))和丙二醛(MDA)含量.结果两组的AST和ALT在肝门开放后10、30、60min均逐渐增高,与术前比
较差异均有统计学意义(P＜0.05);丙泊酚-瑞芬太尼组的AST在T4明显高于异氟烷组(P＜0.05).两组SOD在肝门开放后10、30、60min逐渐降低,T3和T4时与
术前比较差异均有统计学意义(P＜0.05),在T3和T4时异氟烷组的SOD明显低于丙泊酚-瑞芬太尼组(P＜0.05).丙泊酚-瑞芬太尼组的MDA各时间点无显著变
化,异氟烷组的MDA在13和T4时均较术前增高,同时明显高于丙泊酚-瑞芬太尼组(P＜0.05).结论丙泊酚-瑞芬太尼麻醉对肝脏缺血再灌注损伤后超氧化物
歧化酶和丙二醛的影响变化较小,提示其对肝细胞具有较好的保护作用.
5.学位论文陈志新缺血预处理及异氟烷对大鼠离体肺缺血再灌注损伤的影响 2003
目的:第一部分:研究缺血预处理对离体大鼠肺缺血再灌注损伤的影响及其可能机制.第二部分:研究异氟烷对离体大鼠肺缺血再灌注损伤的影响及其
可能机制.结论:1、IP(5min缺血/5min再灌注)可明显减轻离体大鼠肺I/R损伤,2次较1次IP方式的保护效果更明显.IP减轻肺再灌注损伤的机制可能与其抑
制PMN在肺内的聚集,抑制肺组织XOD活性升高,减少氧自由基的生成,增加自由基清除剂SOD的活性,减轻脂质过氧化损伤有关.2、异氟烷可明显减轻离体大
鼠肺I/R损伤,缺血前或再灌注时吸入未见明显差异.异氟烷减轻再灌注肺损伤的机制可能与其抑制PMN在肺内的聚集,减少TNF-α的释放,增加自由基清除
剂SOD的活性,减轻脂质过氧化损伤有关.
6.期刊论文王旭东.卢雅立.王飞.李艳萍.WANG Xu-dong.LU Ya-li.WANG Fei.LI Yan-ping 七氟烷和异氟烷对肝脏
缺血再灌注损伤的影响-中山大学学报（医学科学版）2008,29(1)
[目的] 探讨七氟烷和异氟烷预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤(I/R)的保护作用及机制.[方法] 96只SD大鼠随机分为假手术对照组(Sham)、肝脏缺
血再灌注组(IR)、七氟烷预处理(Sev)和异氟烷预处理组(Iso).于肝脏缺血30 min,再灌注30 min、120 min测各组大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转
氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量以及肝脏组织中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性.[结果] 肝脏缺血再灌注后IR、
Sev和Iso组血清ALT、AST和LDH含量均显著升高,肝组织SOD和GSH显著降低.而MDA明显升高,和Sham组相比有显著差异(P<0.01);Sev、Iso组和IR组比较
,ALT、AST、LDH和MDA降低,而SOD和GSH显著升高(P<0.05或P<0.01),其中Sev组比Iso组效果更为明显(P<0.05或P<0.01).[结论] 七氟烷和异氟烷对肝脏缺
血再灌注损伤有一定的保护作用,这可能与其抑制氧自由基生成,减少脂质过氧化有关.
7.学位论文李进诱导型一氧化氮合酶在异氟烷延迟相预处理心肌保护中的作用 2006
目的：吸入麻醉药预处理可以产生早期时相的抗心肌缺血再灌注损伤的作用，而延迟相的抗心肌缺血再灌注损伤的作用还不清楚。和早期时相预处
理相比，延迟相的预处理不仅能减少缺血再灌注后心肌梗死范围，而且能抗心肌顿抑和心律失常。因此吸入麻醉药的延迟相心肌保护作用有更重要的临
床意义。本研究的目的在于明确异氟烷预处理是否对兔缺血再灌注心肌产生延迟性保护作用，同时研究诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在异氟烷预处理延迟
性心肌保护中的作用。
方法：取36只新西兰白兔建立缺血再灌注模型，即阻断左冠状动脉前降支(LAD)30min，再通3h，造成心肌局部缺血再灌注损伤。36只实验动物随机
分成5组，即(1)对照组：给予生理盐水2ml·kg-1，24h后行LAD缺血再灌注；(2)异氟烷预处理组：给予1MAC的异氟烷持续吸入2h，24h后行LAD缺血再灌
注；(3)1400Wa组：给予选择性iNOS阻滞剂1400W0.5mg·kg-1，24h后行LAD缺血再灌注；(4)1400Wb组：于缺血再灌注前30min给予1400W0.5mg·kg-
1；(5)异氟烷+1400W组：给予1MAC的异氟烷持续吸入2h，24h后行LAD缺血再灌注，在缺血再灌注前30min给予1400W0.5mg·kg-1。监测所有动物缺血再灌
注期间平均动脉压(MAP)、心率(HR)，并计算心率血压乘积(RPP)。心肌缺血再灌注后，取下心脏，分离出左心室，采用红四氮唑(TTC)染色法测定左心室
心肌梗死范围。采用RT-PCR技术检测iNOS基因水平表达，免疫组织化学方法检测iNOS蛋白表达。
结果：各组兔子在缺血再灌注期间，MAP、HR、RPP随着再灌注时间的延长而逐渐下降，但组问差异无显著性(P＞0.05)。各组兔子的体重、左心室重
量、左心室缺血区重量差异无显著性(P＞0.05)。异氟烷预处理组(23.98±2.65％)和对照组(42.14±3.06％)相比心肌缺血再灌注后心肌梗死范围明显减
少(P＜0.01)，1400Wa组(43.68±4.39％)、1400Wb组(43.01±3.69％)、异氟烷+1400W组(42.12±2.60％)和对照组相比心肌缺血再灌注后心肌梗死范围
差异无显著性(P＞0.05)，异氟烷预处理组和异氟烷+1400W组相比，心肌缺血再灌注后心肌梗死范围差异有显著性(P＜0.01)。PT-PCR和免疫组化结果显
示，异氟烷预处理组和对照组相比iNOS在基因水平和蛋白表达水平均增加。
结论：异氟烷延迟相预处理使兔心肌缺血再灌注后心肌梗死范围明显减少，而且这种作用可能是由iNOS所介导。
8.期刊论文燕宪亮.曾因明.许铁.吕建农.张育才.曹汉忠.于常州异氟烷预处理对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的
影响-心血管康复医学杂志2004,13(6)
目的:采用Langendorff离体心脏灌注模型,研究异氟烷预处理对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响.方法:24只SD大鼠随机分为4组,每组6只,分别为
缺血再灌注损伤组(IR组)、异氟烷预处理1组(IsoP 1组)、异氟烷预处理2组(IsoP 2组)和异氟烷预处理3组(IsoP 3组).监测复灌后心功能恢复情况、冠
脉流出液中磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸脱氨酶(LDH)的释放量和心肌存活面积的变化.结果:复灌期间3组IsoP心脏各对应时间点的LVEDP均显著低于对照组
(P＜0.05～＜0.01);再灌注30 min时IsoP各组LVDP的恢复均高于IR组(P＜0.05),IsoP3组±dp/dtmax在再灌注30 min时的恢复百分比均高于IR组
(P＜0.05),IsoP1组+dp/dt max高于IR组(P＜0.05);复灌后异氟烷预处理组各时间点的CK、LDH释放量均低于IR组(P＜0.01);IsoP2组、IsoP1组和IsoP3组
心肌存活面积百分比均高于IR组(P＜0.01);预处理各组之间比较无显著性差异(P＞0.05).结论:IsoP对大鼠离体缺血再灌注心肌有保护作用,可以显著减
轻心肌细胞的损伤,改善心功能,增加心肌存活面积.
9.学位论文汪兵乳化异氟烷延迟相预处理对缺血再灌注损伤兔心肌的作用 2005
目的：吸入麻醉药预处理可以产生早期时相和延迟相的抗心肌缺血再灌注损伤的作用。但吸入麻醉药的吸收需经特殊的挥发罐、气管插管、和使用
呼吸机，从而限制了吸入麻醉药在预处理研究中的应用。如果能够通过静脉途径给予吸入麻醉药，可以更有利于吸入麻醉药在预处理中的应用，尤其是
适合用于延迟相预处理。本研究目的在于探讨乳化异氟烷静脉输注对兔血流动力学和血气的影响，以及是否具有降低缺血再灌注后心肌梗死范围和凋亡
的作用。
方法：新西兰白兔(n=30)随机分为3组。(1)对照组(n=10)：给予生理盐水3.5ml·kg-1·h-1持续30min。(2)脂肪乳组(n=10)：给予脂肪乳
3.5ml·kg-1·h-1持续30min。(3)乳化异氟烷预处理组(n=10)：静脉输注8％乳化异氟烷3.5ml·kg-1·h-1持续30min。Eiso组分别于给药前、给药
20min、给药后10min三个时间点抽动脉血作血气分析。分别于给药前、给药10min、20min、30min和给药后10min、20min、30min记录平均动脉压(MAP)、
心率(HR)和呼吸频率(R)。各组在给药后24h建立缺血再灌注模型，即阻断左冠状动脉前降支(LAD)30min，再灌注3h，造成心肌局部缺血再灌注损伤。采
用红四氮唑(TTC)染色法测定心肌梗死范围。即在缺血再灌注完成后再次阻断LAD，静脉注射伊文蓝，分离左心室，然后进一步分离左心室缺血区(未染色
)和非缺血区(染成蓝色)。缺血区用TTC液孵化后进一步分离梗死区(未染色)和非梗死区(染成红色)，分别称重，梗死区面积用梗死区重量/缺血区重量表
示。采用末端标记技术(TUNEL)检测心肌凋亡指数和免疫组织化学方法(SABC)检测Bcl-2和Bax的蛋白表达。
结果：乳化异氟烷组给药前、给药中和给药后，兔动脉血的pH、PaCO2、PO2、HCO3-、BE、SO2无明显差异(P＞0.05)，MAP、呼吸频率、心率无明显
差异(P＞0.05)。脂肪乳组(45.27±3.03％)和对照组(44.32±2.15％)相比对心肌梗死面积无明显影响。乳化异氟烷组(26.76±2.23％)和对照组、脂肪
乳组相比，缺血再灌注后心肌梗死范围明显减小(P＜0.05)。乳化异氟烷组心肌凋亡明显减少(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表达增加(P＜0.01)，Bax蛋白表达降
低(P＜0.01)。
结论：小剂量乳化异氟烷静脉输注对兔血流动力学和血气无明显影响，并且具有降低缺血再灌注后心肌梗死范围和抗凋亡的作用。
10.期刊论文钱丽萍.朱珊珊.曾因明.QIAN Li-ping.ZHU Shan-shan.ZENG Yin-ming 异氟烷预处理对离体大鼠浅低
温缺血再灌注心肌线粒体耐受性的影响-国外医学（麻醉学与复苏分册）2005,26(3)
目的探讨异氟烷预处理能否诱导浅低温缺血再灌注心肌线粒体耐受.方法采用SD大鼠离体心脏Langendroff灌注模型.建立离体大鼠31℃低温全心缺血
55 min,常温再灌注60 min损伤模型.SD离体大鼠心脏随机分为4组(n=10/组):对照组(CON)用K-H液灌注50 min后31℃低温缺血55 min,常温复灌60min.异
氟烷预处理组(ISC1、ISC2、ISC3),分别在缺血前给予0.5%、1.0%、2.0%的异氟烷预充饱和的K-H液灌注15 min及洗脱15 min.再灌注末,立刻分离心肌线
粒体.观察指标有:LVEDP、LVSP、dp/dtmin、dp/dtmax、HR、梗死面积、线粒体和胞浆的细胞色素C.结果同对照组相比,复灌30min及60min时,各组LVSP、
dp/dtmin、dp/dtmax、HR均无显著差异,仅ISC3组的LVDEP显著低于CON组(P＜0.05).复灌60 min后ISC2组和ISC3组梗死面积显著低于CON组和ISC1组
(P＜0.05).异氟烷预处理使浅低温缺血再灌注后心肌线粒体细胞色素C的释放减少.与CON组相比ISC3组胞浆细胞色素C的量明显减少(P＜0.05),同时伴随
线粒体的细胞色素C显著增加(P＜0.05),ISC2组线粒体细胞色素C的量也显著多于CON组(P＜0.05).结论异氟烷预处理能通过诱导线粒体耐受(以线粒体细
胞色素C丢失为线粒体功能障碍指标)抗心肌浅低温缺血再灌注损伤.
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1401956.aspx
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