外源性胰岛素对于胰岛素一相分泌的影响

【摘要】  目的： 探讨外源性胰岛素对离体大鼠胰岛第一时相胰岛素分泌的影响. 方法： 雄性SD大鼠胰腺采用Ⅴ型胶原酶经胰管灌注消化分离得到胰岛，用100 μU/mL外源性胰岛素分别孵育0， 60，120和240 min（n=8）后，给予葡萄糖刺激，分别测定0，3，5，10和30 min胰岛素分泌量. 结果：不同时间胰岛素预处理后，各组在葡萄糖刺激时均产生胰岛素第一时相分泌（P<0.05），但随着胰岛素孵育时间的延长，胰岛素第一时相分泌峰值降低（P<0.01）. 结论：100 μU/mL外源性胰岛素损害胰岛素第一时相分泌，且孵育时间越长，抑制程度越明显.
【关键词】  胰岛；细胞，培养的；大鼠；胰岛素；时间反应曲线
正常人的β细胞受到葡萄糖负荷刺激时呈双相式胰岛素分泌. 第一时相胰岛素分泌表现在β细胞受到葡萄糖刺激后l  min开始，3～5 min时达峰值，持续约10 min. 第一时相胰岛素分泌虽然短暂，但在调节血糖水平中具有重要的生理意义. 葡萄糖诱导的胰岛素第一时相分泌受损是胰岛β细胞功能障碍的最早标志［1］，并预示着2型糖尿病的发生. 目前外源性胰岛素对胰岛β细胞胰岛素分泌的作用尚无定论，有关对胰岛素第一时相分泌的影响的研究报道也较少. 本研究通过观察离体胰岛在外源性胰岛素预处理后对葡萄糖刺激的第一时相分泌的变化，为进一步探讨外源性胰岛素对于胰岛β细胞胰岛素第一时相分泌的影响提供依据.
1材料和方法
1.1材料
雄性SD大鼠35只，体质量 250～300 g，购于第四军医大学试验动物中心. 胶原酶V， Histopaque1077，双硫腙购于美国Sigma公司；胰岛素放免试剂盒购于北京北免东雅公司；RPMI1640，小牛血清购于Gibco公司；其他试剂均为国产分析纯. 胶原酶Ⅴ溶液含NaCl 124 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2 7.5 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，NaHCO3 2.4 mmol/ L，葡萄糖3 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，V型胶原酶 0.60 g/L（pH 7.8）.
1.2方法
1.2.1胰岛的分离及纯化
固定大鼠后备皮，200 g/L乌拉坦7 mL/kg腹腔注射麻醉. 剖腹充分暴露胰腺,于无菌条件下胆总管内插入4.5号头皮针，逆行注入预冷的胶原酶Ⅴ溶液8～10 mL，使胰腺膨胀，迅速摘取整个胰腺，38℃水浴中静止消化10 min. 振荡15 s使其呈细砂状，充分分散胰腺组织，再加入4℃小牛血清10 mL与4℃ Hanks液30 mL终止消化. 40目筛网过滤，除去未完全消化的组织，之后1000 r/min离心2 min，弃上清液，加入Hanks液清洗组织，重复以上三个步骤3～5次，直至离心后上清中无杂物. 完全弃去上清，加入Histopaque1077约5 mL，充分混匀，移入15 mL离心管，然后小心加入Hanks液约5 mL，形成一个层面. 逐渐加速至2000 r/min离心20 min. 在Hanks液与Histopaque1077形成的层面上收集胰岛. 用RPMI 1640 洗2遍后1000 r/min离心2 min即得到纯化后的胰岛［2］.
1.2.2胰岛的鉴定
胰岛用双硫腙溶液鉴定［3］. 双硫腙溶液配制如下：10 mg双硫腙溶于3 mL无水乙醇中，加入3滴1 mmol/L氨水溶液，形成深红色母液，用Hanks液1∶10稀释,然后加入到收集纯化胰岛中，记数红染细胞团.
1.2.3胰岛素胰岛孵育及胰岛素分泌功能测定
将分离纯化后的胰岛放入预先加有RPIM1640培养液的24孔板，50个胰岛/孔，加入外源性胰岛素使其终浓度达100 μU/mL孵育胰岛，分别孵育0， 60，120和240 min，（设0 min为对照组）然后用Hanks液（含3 mmol/L葡萄糖）洗涤2遍中止孵育. 每孔加入Hanks液定容1 mL，给予终浓度为16.7 mmol/L葡萄糖刺激（240 min组再给予终浓度为16.7 mmol/L葡萄糖加10  mmol/L精氨酸刺激），分别在0，3，5，10和30 min吸取上清100 μL 作为待检样品，每个孵育组各重复8次，用放射免疫法测定胰岛素分泌情况.
统计学处理：  计量资料用x±s表示，组间比较使用SPSS 11.0软件进行方差分析及LSDt检验.
2结果
2.1胰岛的形态及活性
大鼠胰腺经胶原酶消化及纯化后，获得分散较好、纯度较高的胰岛，呈圆形或椭圆形，胰岛结构完整，界限清楚，镜下为不透光实体，双硫腙染色呈深红色（图1），表明为含有β细胞的胰岛细胞团，每只大鼠胰腺平均获得直径在100~300 μm之间的胰岛约为（337.80 ±21.36)个.
2.2时间反应曲线
研究结果显示：虽然各组均产生第一时相胰岛素分泌（P<0.05），但随着预处理时间的延长，胰岛素第一时相分泌峰值减低（P<0.01, 表1），胰岛素孵育60 min组葡萄糖刺激后5 min时的峰值较对照组减少近54%， 120 min组减少近72%，240 min后胰岛素第一时相分泌损害更为明显，减少超过85%. 但当胰岛素孵育240 min时，同时给予16.7 mmol/L葡萄糖加10 mmol/L精氨酸刺激时，胰岛素第一时相分泌几乎完全恢复（P>0.05）.
表1不同孵育时间的胰岛素分泌量（略）
3讨论
关于胰岛素对于胰岛素分泌调控的作用的实验报道因不同的条件和不同的动物模型而结果不一，得出的结论差异颇大. 对于在啮齿类和人类胰岛素如何调节胰岛素本身的分泌目前仍没有定论. Borge等［4］认为胰岛素通过自分泌方式正反馈刺激胰岛素分泌. 其试验表明，长期胰岛素处理导致小鼠胰岛β细胞［Ca2+］i持续性增高，并增加了葡萄糖刺激的胰岛素分泌. 另有报道表明，胰岛素类似剂 L783281可增加体外培养的C57BL/6J小鼠胰岛的葡萄糖刺激的胰岛素分泌［5］. 胰岛β细胞内的胰岛素信号途径具有抑制胰岛素分泌的功能，胰岛素灌注大鼠胰腺可抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌［6］.  Khan等［7］报道的在小鼠胰岛素细胞上胰岛素可以通过PI3K途径激活KATP通道，抑制细胞的去极化和兴奋性，降低［Ca2+］i，而IGF1则没有此作用. 此结果也提示胰岛素可特异性地通过自分泌的方式负反馈抑制本身的分泌.
我们的结果发现：在100 μIU/mL外源性胰岛素环境中，虽然给予葡萄糖刺激时胰岛素第一时相分泌仍然存在，但其分泌量已经明显减少，尤其是随着孵育时间的延长，胰岛素第一时相分泌峰值更是逐步递减.  这提示在较高的外源性胰岛素环境中，对胰岛β细胞胰岛素第一时相分泌发挥负反馈抑制作用，尤其是随着作用时间的延长，这种负反馈抑制作用越明显.
值得一提的是，当100 μU/mL外源性胰岛素孵育胰岛240 min时，同时给予葡萄糖和精氨酸刺激时，其受损殆尽的胰岛素第一时相分泌又重新恢复. 这说明精氨酸刺激胰岛素分泌的途径与葡萄糖的作用不同，有助于受损的胰岛素第一时相分泌的恢复，但也不排除两种刺激物的协同作用，相关的机制有待进一步研究.
【参考文献】
［1］Gerich JE. Is reduced firstphase insulin release the earliest detectable abnormality in individuals destined to develop type 2 diabetes ［J］.Diabetes, 2002, 51 (1): S117-S121.
［2］张雷, 吴德全, 孙岩, 等. 大鼠胰岛分离的影响因素［J］. 中华内分泌代谢杂志, 2002, 18(6): 491-492.
［3］Josefsen K, Stenvang JP, Kindmark H, et al. Fluorescenceactivated cell sorted rat islet cells and studies of the insulin secretory process ［J］. J Endocrinol, 1996, 149: 145-154.
［4］Borge PD, Moibi J, Greene SR, et al. Insulin receptor signaling and sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase in betacells［J］. Diabetes, 2002, 51:S427-S433.
［5］Weterlund J, Wolf BA, Bergsten P. Glucosedependent promotion of insulin release from mouse pancreatic islets by the insulinmimetic compound L783,281［J］. Diabetes, 2002, 51:S50-S52.
［6］Ammon HP, Reiber C, Verspohl EJ. Indirect evidence for shortloop negative feedback of insulin secretion in the rat［J］. J Endocrinol, 1991, 128:27-34.
［7］Khan FA, Goforth PB, Zhang M, et al. Insulin actives ATPsensitive K(+) channels in pancreatic betacells through a phosphatidylinositol 3kinasedependent pathway［J］. Diabetes, 2001, 50:2192-2198.